Επίδραση της ενεργοποίησης των μηχανισμών άμυνας του βλεννογόνου του εντέρου του ποντικού με cholera-toxin στην παθογένεια της κολίτιδας και του αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου

Abstract

Aim of this study was to examine the extent in which severity-character of chronic inflammatory response in colonic mucosa can determine the progression of early neoplastic lesions. For this, 90 male mice were used. Azoxymethane (AOM) was used for initiation, dextran sodium sulfate (DSS) for the inflammatory-associated promotion of colon carcinogenesis and cholera-toxin (CT) peros, which has been shown to effectively modulate gut mucosal immunity. Mice were divided into 8 experimental groups:AOM-DSS-CT, AOM-DSS, AOM-CT, AOM, DSS-CT, CT, DSS and Control. Animals were necropsied 3.5 months post-treatment. In order to determine the effect of CT in early stages of carcinogenesis another experiment was performed (AOM-DSS-CT, AOM-DSS groups), where mice were necropsied three days post-treatment. In long-term experiment, mice treated with AOM and DSS were found to have adenomatous colonic polyps with focal low grade dysplasia, high grade dysplasia and carcinoma in situ lesions. Immunohistochemically, neoplastic cells showed increased proliferation and apoptosis, as well as abnormal expression of β-catenin, E-cadherin and Tgfβ-1. Most inflammatory cells were detected at the base of polyp. The most numerous inflammatory cells found were neutrophils (MPO+) and macrophages (F4/80+) and the least, mast cells. The non-neoplastic large bowel mucosa of AOM-DSS-treated mice at 3.5 months post-treatment had no histologically-detectable colitis, but shared focal low and high grade dysplastic lesions with histopathological/immunohistochemical features similar with those described in polyps. Compared to various control groups, this group had increased neutrophils and lymphocytes in colonic mucosa. In the AOM-DSS-CT group a total of 5 polyps were found in 3/10 mice whereas 7/10 AOM-DSS mice had a total of 20 colonic polyps, sharing similar histopathological features. CT significantly reduced dysplastic lesions in the non-neoplastic mucosa. CT also induced significant decrease in MPO+ cells and increase in regulatory T-cells in mucosa and in mesenteric lymph nodes. Expression of IL-6, IL-10 and TNF-α in non-neoplastic mucosa using Real-Time PCR and immunohistochemical analysis of IL-6, Tgf-β1, IL-17, ki67 and caspase-3 revealed no statistically significant differences (AOM-DSS, AOM-DSS-CT groups). Results of this long-term experiment suggest that administration of CT during cancer initiation and inflammatory-associated promotion, suppressed colorectal carcinogenesis in mice. Although colonic histology was restored, immune cell composition in mucosa varied between CT-treated and non-treated mice. Administration of CT was correlated with increased regulatory T-cells and less neutrophils, suggesting that tumor-suppressor ability of CT lies partially, in its immunomodulatory properties. In order to determine the CT-induced alterations in mucosal immunity at the critical early stages of carcinogenesis, the short-term experiment was introduced. Dysplastic glands detected had similar immunohistochemical features to those detected at the 3.5 months time-point. CT did not affect histopathological grade of colitis/dysplasia. However, it significantly decreased MPO+ and CD3+ cells in mucosa and increased regulatory T-cells (mucosa, MLN). Gene expression (Real-Time PCR) showed that IL-10 and TNF-α were significantly upregulated in colonic mucosa of CT-treated mice. IL-6, IL-17, ki67 and caspase-3 expression did not immunohistochemically differ between two groups. In conclusion, we show that modifying immunity-associated millieu in the microenviroment of preneoplastic lesions-initiated due to genetic damage-can determine the fate of lesions.

Στόχος της διατριβής ήταν να μελετήθεί σε ποιο βαθμό η ένταση/χαρακτήρας της χρόνιας φλεγμονής στο βλεννογόνο του παχέος εντέρου κατά την έναρξη της νεοπλασματογένεσης επηρεάζει την εξέλιξη των πρoνεοπλαστικών αλλοιώσεων. Χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 90 αρσενικοί ποντικοί. Για την «έναρξη» της νεοπλασματογένεσης χορηγήθηκε αζοξυμεθάνιο(AOM), ενώ για την «προαγωγή» (μέσω κολίτιδας) εστέρας δεξτράνης με θειικό νάτριο(DSS) καθώς και κατάλληλη δόση της χολέρα-τοξίνης(CT) peros, που τροποποιεί την απόκριση του ανοσοποιητικού στον εντερικό βλεννογόνο. Ανάλογα με τις χορηγούμενες ουσίες, προέκυψαν 8 πειραματικές ομάδες:AOM-DSS-CT, AOM-DSS, AOM-CT, AOM, DSS-CT, CT, DSS και Control. Οι ποντικοί νεκροτομήθηκαν 3,5 μήνες μετά τη χορήγηση ουσιών, ενώ για τη διερεύνηση της επίδρασης της CT στα αρχικά στάδια της καρκινογένεσης, πραγματοποιήθηκε επιπλέον πειραματισμός (ομάδες AOM-DSS-CT, AOM-DSS), όπου οι ποντικοί νεκροτομήθηκαν 3 ημέρες μετά την χορήγηση ουσιών. Στο μακροπρόθεσμο πειραματισμό, τα πειραματόζωα που έλαβαν ΑΟΜ και DSS εμφάνισαν αδενωματώδεις πολύποδες με εστίες χαμηλού-υψηλού βαθμού δυσπλασίας και καρκινώματος in situ. Ανοσοϊστοχημικά τα νεοπλασματικά κύτταρα στους πολύποδες χαρακτηρίζονταν από έντονο πολλαπλασιασμό και απόπτωση, μη φυσιολογική έκφραση β-κατενίνης, E-καντχερίνης και του Tgfβ-1. Η τοπογραφική κατανομή των φλεγμονικών κυττάρων ήταν κυρίως στη βάση του πολύποδα. Τα πλέον πολυάριθμα φλεγμονικά κύτταρα ήταν τα ουδετερόφιλα (MPO+) και τα μακροφάγα (F4/80+), ενώ ελάχιστα ήταν τα σιτευτικά. Στο βλεννογόνο του παχέος εντέρου (εκτός πολυπόδων) δεν παρατηρήθηκε κολίτιδα. Ωστόσο, βρέθηκαν εστίες δυσπλαστικών αδένων με ιστοπαθολογικά-ανοσοϊστοχημικά χαρακτηριστικά ανάλογα των πολυπόδων καθώς και αυξημένοι αριθμοί ουδετερόφιλων και Τ-λεμφοκυττάρων σε σχέση με τους μάρτυρες. Επίσης, παρατηρήθηκαν συνολικά 5 πολύποδες σε 3/10 ποντικούς ομάδας AOM-DSS-CT, ενώ 20 σε 7/10 ποντικούς ομάδας AOM-DSS. Οι πολύποδες και των δύο ομάδων εμφάνιζαν παρόμοια ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά, ενώ ο βλεννογόνος του παχέος εντέρου (εκτός πολυπόδων) των ποντικών που είχαν λάβει CT είχε σημαντικά λιγότερη δυσπλασία. Επιπλέον, η χορήγηση CT σχετίστηκε με στατιστικώς σημαντική μείωση του αριθμού των MPO-θετικών κυττάρων στο βλεννογόνο του παχέος εντέρου και με αύξηση σ’αυτόν αλλά και στα μεσεντέρια λεμφογάγγλια του αριθμού των ρυθμιστικών Τ-λεμφοκυττάρων. Συμπεραίνεται ότι στο μακροπρόθεσμο πειραματισμό η χορήγηση CT, κατέστειλε σημαντικά την καρκινογένεση στο παχύ έντερο. Στο χρονικό αυτό διάστημα, αν και η ιστοπαθολογική εικόνα του παχέος εντέρου(εκτός πολυπόδων) είχε γενικά αποκατασταθεί, διέφερε η σύσταση των φλεγμονικών κυττάρων μεταξύ των ομάδων των ποντικών. Για να διαπιστωθούν οι μεταβολές στο ανοσοποιητικό σύστημα του βλεννογόνου από τη CT στα κρίσιμα αρχικά στάδια της καρκινογένεσης, πραγματοποιήθηκε ο δεύτερος-βραχυπρόθεσμος πειραματισμός. Οι δυσπλαστικοί αδένες χαρακτηρίζονταν από όμοια ανοσοϊστοχημικά ευρήματα με αυτά που περιγράφηκαν για τη δυσπλασία στους 3,5 μήνες. Η κολίτιδα-δυσπλασία του βλεννογόνου των δύο πειραματικών ομάδων ήταν παρεμφερής. Ωστόσο, βρέθηκε ότι η χορήγηση CT σχετίζεται με σημαντική μείωση του αριθμού των MPO+ και CD3+ κυττάρων στο βλεννογόνο και με σημαντική αύξηση των ρυθμιστικών Τ-λεμφοκυττάρων (βλεννογόνος και μεσεντέρια λεμφογάγγλια) ενώ δεν επηρέασε την παρουσία των μακροφάγων-σιτευτικών κυττάρων στις δύο ομάδες. Η έκφραση των IL-10, και TNF-α (Real Time-PCR), ήταν σημαντικά αυξημένη στην ομάδα ΑΟΜ-DSS-CT. Η έκφραση των IL-6, IL-17, απόπτωσης και πολλαπλασιασμού ελέγχθηκαν ανοσοϊστοχημικά, χωρίς όμως διαφοροποιήσεις μεταξύ των πειραματικών ομάδων. Συμπερασματικά, καταδεικνύεται ότι η τροποποίηση των παραγόντων του ανοσοποιητικού στο μικροπεριβάλλον των προνεοπλασματικών αλλοιώσεων λόγω γονιδιακής βλάβης των κυττάρων, επηρεάζει την τύχη των αλλοιώσεων.