Preparation and fusion of protoplasts from the phytopathogenic fungus Sclerotium rolfsii (Sacc.)

Abstract

Sclerotium rolfsii (Sacc.) is a serious plant pathogenic fungus. It causes extensive economic losses to most important crops. This fungus does not produce asexual spores. Its perfect (basidial) stage has been reported extremely rare in nature. These genetic barriers are obstacles for the development of new strains in this fungus. Protoplast fusion technology is the only method to overcome these barriers in this fungus. In nature, the fungus occurs in two strains designated as A and R. These two strains of the plant pathogenic fungus Sclerotium rolfsii (Sacc.) were used for protoplast formation. As protoplast fusion has not yet been reported in this fungus. Therefore, the construction of fusants by protoplast fusion in this fungus and their study can lead further understanding of the genetic basis of pathogenicity of this fungus. Two strains of the plant pathogenic fungus Sclerotium rolfsii (Sacc.) were used for the formation of protoplast. The sterilized 9 cm semi-permeable cellophane membranes were used in Petri dishes containing PDA. One g of 3-days old mycelia of each strain was harvested from Petri dishes. The mycelia were pretreated with 0.9 M NaCl for ½ hour. The mycelia were washed with sterilized distilled water. The washed mycelia were placed in the reaction mixture in a total volume of 10ml, containing lysing enzyme (Trichoderma) 15mg/ml in 1M sucrose at pH 5.8 in 50ml Erlenmeyer flasks. The flasks were incubated in a rotary shaker incubator operating at 75 rpm for 24 hours at 25 oC. The samples were taken at 6, 12 and 24 hours intervals. Strain A gave a maximum protoplast yield of 3.8x105 / g mycelia while, strain R gave a maximum protoplast yield of 2.8x105 / g mycelia. The size of the protoplasts of both strains was determined using a haemocytometer under the microscope. An average diameter of 15 mm of the protoplasts of both strains, A and R was determined by measuring 150 protoplasts of each strain randomly. The following osmotic stabilizers were evaluated : sucrose 1M, NaCl 1M, MgSO4 1M, NH4Cl 1M and KCl 0.9M. Sucrose 1M gave the highest protoplast yield, followed by NaCl 1M. MgSO4 1M was also found good stabilizing agent. KCl 0.9M was found least satisfactory. The different commercial enzymes, namely lysing enzyme (Trichoderma), cellulase (Aspergillus niger), driselase (Basidiomycetes), chitinase (Serretia marcescens) and beta-glucuronidase (Helix pomotia) were tested for protoplast yields. All enzymes tested did not form protoplasts in both strains except the lysing enzyme. The lysing enzyme at the concentration of 15mg/ml was found best resulting in maximum protoplast yield. The study of the regeneration of protoplasts of the both strains was carried out in both liquid and solid media. Protoplasts of both strains were reverted to their normal mycelial cells. Protoplasts of the strains A and R were fused. An aliquot of 0.5ml containing 1x105 of purified protoplasts of both strains was mixed in fusion medium. The volume of the fusion medium was 1ml containing PEG 4000 30% (w/v) with 0.2 mM CaCl2 , incubated for ½ hour and plated on Petri dishes containing regeneration medium. One ml of osmotic stabilizer was added to the medium prior to the addition of protoplasts. The fusion products were recovered from the Petri dishes containing regeneration media. Four fusants were recovered and designated as F1, F2, F3 and F4. Stability experiments of protoplasts were conducted for three generations. The growth rate, morphology of mycelia, pattern of sclerotial formation and the size of sclerotia of the fusants were investigated as compared to the parent strains A and R. The three fusants F1, F2 and F4 were found stable while, the F3 was found unstable. Green house pot experiments were conducted for the study of pathogenicity of fusants as compared to the parent strains A and R. Three crops, namely tomato, carrots and beans were used as host crops. The plants were grown in plastic bags. The soil was mixed with mycelial slurry of each fusant and the parent strains A and R. The control treatment was without any mycelia. The growth parameters, like plant height, number of leaves, leaf mid rib length, fresh and dry weight of the two months old plants were investigated. The data were analyzed statistically using one-way ANOVA and LSD test at 0.05% level using SPSS 9.0. The means of each treatment were compared for significance. Physiological parameters, like chlorophyll flourescence and chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoids were measured only in beans. The pathogenic parameters, including plant mortality, leaf color and wilting of plants were also investigated. A maximum mortality of (78%) was observed in beans in strain A. Other pathogenic symptoms like yellow brown color of leaves and wilting of plants were noted in R in beans. Among the fusants, F1 and F4 were found virulent in carrots while F2 was found non-virulent. All the fusants showed growth promoting behavior in beans. Among host crops, tomato was found to be resistant to the fusants as well as the parent strains A and R. The carrots were found to be more susceptible to the fusants as compared to the parent strains. Beans exhibited a differential pathogenic behavior towards the parent strains A and R and fusants. They were found resistant to the fusants and highly susceptible to the parent strains A and R.

Ο μύκητας Sclerotium rolfsii (Sacc.) είναι ένας σημαντικός φυτοπαθογόνος μύκητας. Προκαλεί εκτεταμένες οικονομικές απώλειες σε πολλά σημαντικά αγροστώδη. Αυτός ο μύκητας δεν παράγει αφυλετικά σπόρια. Το τέλιο (βασιδιακό) του στάδιο συναντάται πολύ σπάνια στη φύση. Αυτές οι γενετικές δυσκολίες αποτελούν εμπόδιο για τη δημιουργία νέων στελεχών σ’ αυτόν το μύκητα. Η τεχνολογία σύντηξης πρωτοπλαστών είναι η μοναδική μέθοδος για να ξεπεραστούν αυτά τα εμπόδια, στον μύκητα αυτόν. Στην φύση αυτός ο μύκητας υπάρχει σε δύο στελέχη, που διακρίνονται ως Α και R. Αυτά τα δύο στελέχη του φυτοπαθογόνου μύκητα Sclerotium rolfii χρησιμοποιήθηκαν για τον σχηματισμό πρωτοπλαστών. Η σύντηξη πρωτοπλαστών δεν έχει επιτευχθεί ακόμη γι’ αυτόν τον μύκητα. Έτσι, τα προϊόντα σύντηξης που προκύπτουν από τη σύντηξη πρωτοπλαστών σ΄αυτόν το μύκητα και η μελέτη τους μπορεί να οδηγήσει στην περεταίρω κατανόηση της γενετικής βάσης της παθογένειας αυτού του μύκητα. Χρησιμοποιήθηκαν αποστειρωμένες ημιπερατές μεμβράνες σελοφάν σε τριβλία Petri που περιείχαν PDA. Από τα τριβλία Petri συλλέχθηκε ένα γραμμάριο μυκηλίου 3 ημερών από κάθε στέλεχος. Αφού τοποθετήθηκαν σε 0.9Μ NaCl για μισή ώρα ξεπλύθηκαν με αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό. Στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε φιάλες Erlenmeyer των 50ml που περιείχαν το μείγμα αντίδρασης με το lysing ένζυμο (Trichoderma) (15mg/ml σε 1Μ σουκρόζης, pH 5.8), συνολικού όγκου 10ml. Το όλο σύστημα επωάστηκε σε περιστροφικό αναδευτήρα για 24 ώρες (75 rpm στους 25 oC). Δείγματα λαμβάνονταν σε χρονικά διαστήματα 6, 12 και 24 ωρών. Το στέλεχος Α έδωσε μία μέγιστη απόδοση πρωτοπλαστών της τάξης των 3,8x105/g , ενώ η μέγιστη απόδοση του στελέχους R ήταν 2,8x105/g . Το μέγεθος των πρωτοπλαστών και των δύο στελεχών προσδιορίστηκε με τη χρήση αιματοκυταρομέτρου στο μικροσκόπιο. Μία μέση διάμετρος 15μm πρωτοπλαστών τόσο του Α όσο και του R στελέχους ήταν το αποτέλεσμα των τυχαίων μετρήσεων 150 πρωτοπλαστών από κάθε στέλεχος. Ακολούθησε η εκτίμηση της δράσης των εξής οσμωτικών σταθεροποιητών: σουκρόζης 1M, NaCl 1M, MgSO4 1Μ, NH4Cl 1M και KCl, 0.9M. H σουκρόζη 1Μ έδωσε τη μέγιστη απόδοση σε πρωτοπλάστες, ακολουθούμενη από το NaCl 1M. Το MgSO4 1Μ αποδείχθηκε επίσης καλό μέσο σταθεροποίησης, σε αντίθεση με το KCl 0.9M. Διάφορα εμπορικά ένζυμα και συγκεκριμένα το lysing ένζυμο (Trichoderma), η κυτταρινάση (Aspergillus niger), η driselase (Basidiomycetes), η χιτινάση (Serretia marcescens) και η β-γλουκουρονιδάση (Helix pomotia) εξετάστηκαν ως προς την απόδοση των πρωτοπλαστών. Από όλα τα παραπάνω, μόνο το lysing ένζυμο βρέθηκε να σχηματίζει πρωτοπλάστες και στα δύο στελέχη, με τη μέγιστη απόδοση να παρατηρείται στη συγκέντρωση των 15mg/ml. Η μελέτη της αναγέννησης των πρωτοπλαστών και στα δύο στελέχη πραγματοποιήθηκε τόσο σε υγρό, όσο και σε στερεό μέσο. Οι πρωτοπλάστες και των δύο στελεχών επανήλθαν και πάλι στα κανονικά κύτταρα τους. Ακολούθησε σύντηξη των πρωτοπλαστών. Χρησιμοποιήθηκαν 0.5ml από κάθε στέλεχος που περιείχαν 1x105 καθαρών πρωτοπλαστών, τα οποία και αναμείχθηκαν στο μέσο σύντηξης. Ο όγκος του τελευταίου ήταν 1ml και περιείχε PEG 4000 30% (w/v) με 0.2mM CaCl2, επωασμένα για μισή ώρα και τοποθετημένα στο τρυβλίο Petri με το μέσο αναγέννησης. Ένα ml του ωσμωτικού σταθεροποιητή προστέθηκε στο μέσο πριν τοποθετηθούν οι πρωτοπλάστες υπό σύντηξη. Τα προϊόντα της σύντηξης ανακτήθηκαν από τα τρυβλία Petri που περιείχαν το μέσο αναγέννησης και ονομάστηκαν F1, F2, F3 και F4. Ο έλεγχος σταθερότητας των νέων ανασυνδυασμένων στελεχών πραγματοποιήθηκε σε τρεις γενιές. Προσδιορίστηκε ο ρυθμός ανάπτυξης, η μορφολογία των, το πρότυπο του σχηματισμού και το μέγεθος των σκληροτίων και έγιναν συγκρίσεις με τα αντίστοιχα μεγέθη των αρχικών στελεχών A και R. Τα F1, F2 και F4 αποδείχθηκαν σταθερά, ενώ το F3 όχι. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν πειράματα με φυτά στο θερμοκήπιο προκειμένου να ελεγχθεί η παθογένεια των προϊόντων της σύντηξης σε σχέση με τα αρχικά στελέχη. Τρία είδη καλλιεργούμενων φυτών χρησιμοποιήθηκαν ως ξενιστές: η ντομάτα, το καρότο και η φασολιά. Τα φυτά αναπτύχθηκαν σε πλαστικά σακουλάκια, με χώμα αναμεμειγμένο με μυκηλιακό εναιώρημα από κάθε στέλεχος. Τα φυτά-μάρτυρες αναπτύχθηκαν χωρίς. Σε όλα τα φυτά μετρήθηκαν μορφολογικές παράμετροι, όπως το ύψος του φυτού, ο αριθμός και το μήκος του νεύρου των φύλλων καθώς και η βιομάζα, νωπή και ξηρή όταν τα φυτά έφτασαν την ηλικία των δύο μηνών. Τα δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικώς με one-way ANOVA και LSD test σε επίπεδο P=0.05, με τη χρήση του στατιστικού πακέτου SPSS 9.0. Φυσιολογικές παράμετροι, όπως οι συγκεντρώσεις των χλωροφυλλών α και b, καθώς και των καροτενοειδών μετρήθηκαν μόνο στη φασολιά. Τέλος, προσδιορίστηκαν κάποιες παράμετροι παθογένειας που περιελάμβαναν ρυθμό θνησιμότητας, χρώμα φύλλου και το μαρασμό των φυτών. Το μέγιστο ποσοστό θνησιμότητας (78%) παρατηρήθηκε σε φασολιές μολυσμένες με το στέλεχος Α. Άλλα συμπτώματα παθογένειας, όπως κίτρινα ή καφέ φύλλα και μαρασμός των φυτών παρατηρήθηκαν σε φασολιές με το R στέλεχος. Μεταξύ των προϊόντων της σύντηξης, για το καρότο τα F1 και F4 αποδείχτηκαν παθογόνα το δε F2 όχι, ενώ για τη φασολιά όλα είχαν ευνοϊκή επίδράση σε ότι αφορά την ανάπτυξη. Συμπερασματικά, η ντομάτα αποδείχθηκε εξαιρετικά ανθεκτική τόσο απέναντι στα αρχικά στελέχη όσο και σε αυτά που προέκυψαν από τη σύντηξη. Το καρότο φάνηκε ευπαθές απέναντι στα προϊόντα της σύντηξης και ανθεκτικό στα αρχικά στελέχη, ενώ ακριβώς το αντίθετο καταγράφηκε στη φασολιά.