Χαρακτηρισμός της επίδρασης του εκκριτώματος των CDC6oe κυττάρων στο σηματοδοτικό μονοπάτι ERK/MARK

Abstract

Cellular senescence is a state of permanent cell-cycle arrest in which cells remain metabolically active. It functions as a physiological safeguard against uncontrolled cell proliferation and is closely associated with the accumulation of DNA damage. Overexpression of genes involved in replication licensing can induce replication stress and abnormal cell growth, ultimately leading to senescence. One such gene is CDC6, which encodes a key component of the DNA replication machinery. In this dissertation, a CDC6-inducible expression system was used to investigate the metabolic and molecular alterations accompanying replication-stress–induced senescence. CDC6 overexpression triggered a transient increase in proliferation duringthe first two days, followed by a gradual decline and full establishment of molecular and phenotypic markers of senescence by day three. At the metabolic level, marked alterations were observed, most notably increased glucose levels and dynamic changes in putrescine abundance. Targeted metabolomic analysis revealed an initial rise in intracellular putrescine followed by a sharp decline upon senescence onset, concomitant with the accumulation of SA-β-gal–positive cells. This decrease in putrescine was reflected in reduced expression of ODC1, the ratelimiting enzyme of its de novo biosynthesis, as well as suppression of transcriptional regulators controlling ODC1 expression, including MYC. Glucose-modification experiments demonstrated that glucose deprivation does not influence senescence induction. In contrast, exogenous putrescine administration delayed the appearance of the senescence phenotype and reduced TP53 levels, whereas ODC1 silencing accelerated senescence and increased TP53 accumulation, confirming the central role of the ODC1–putrescine axis. Mechanistically, CDC6 was found to regulate polyamine biosynthesis through a signaling circuit involving ERK,GSK3β, and MYC: early ERK activation stabilizes MYC, while prolonged CDC6 activation promotes GSK3β-dependent MYC degradation, leading to reduced ODC1 expression and commitment to senescence. Exogenous putrescine restored MYC, ODC1, and pERK levels, highlighting the presence of a reversible signaling–metabolic loop. Furthermore, analysis of single-cell RNA-seq data from COVID-19 patients revealed reduced MYC and ODC1 expression in alveolar epithelial cells exhibiting senescence markers, suggesting that this axis may also operate in the lung epithelium under stress conditions. In conclusion, these findings identify putrescine as a critical metabolic checkpoint inreplication-stress–induced senescence.

Η κυτταρική γήρανση αποτελεί κατάσταση μόνιμης αναστολής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, κατά την οποία τα κύτταρα παραμένουν μεταβολικά ενεργά. Αποτελεί φυσιολογικό μηχανισμό προστασίας έναντι της ανεξέλεγκτης κυτταρικής αύξησης και συνδέεται με τη συσσώρευση βλαβών στο DNA. Η υπερέκφραση γονιδίωνπου εμπλέκονται στην αντιγραφική αδειοδότηση μπορεί να προκαλέσει αντιγραφικόστρες και ανώμαλη κυτταρική αύξηση, οδηγώντας στην εγκαθίδρυση γήρανσης. Ένα τέτοιο γονίδιο είναι το CDC6, το οποίο κωδικοποιεί κρίσιμο παράγοντα της μηχανής αντιγραφής του DNA. Σε αυτή τη διατριβή χρησιμοποιήθηκε σύστημα επαγώγιμης έκφρασης του CDC6 για τη διερεύνηση των μεταβολικών και μοριακών μεταβολών που συνοδεύουν τη γήρανση που επάγεται από αντιγραφικό στρες. Η υπερέκφραση του CDC6 οδήγησε σε παροδική αύξηση του πολλαπλασιασμού τις δύο πρώτες ημέρες, ακολουθούμενη από σταδιακή μείωση και πλήρη εγκαθίδρυση μοριακών και φαινοτυπικών δεικτών γήρανσης την τρίτη ημέρα. Σε μεταβολικό επίπεδο παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές, με πλέον χαρακτηριστικές την αύξηση της γλυκόζης και τις δυναμικές αλλαγές των επιπέδων πουτρεσκίνης. Στοχευμένη μεταβολομική ανάλυση έδειξε αρχική αύξηση της πουτρεσκίνης και απότομη πτώση με την εγκαθίδρυση της γήρανσης, παράλληλα μεσυσσώρευση SA-β-gal θετικών κυττάρων. Η μείωση της πουτρεσκίνης αντανακλάταιστη μείωση της ODC1, του ενζύμου της de novo βιοσύνθεσής της, καθώς και στην καταστολή μεταγραφικών παραγόντων που ρυθμίζουν την έκφρασή της ODC1, όπως οMYC. Πειράματα με τροποποίηση της γλυκόζης έδειξαν ότι η έλλειψή της δεν επηρεάζει τη γήρανση. Αντιθέτως, η εξωγενής χορήγηση πουτρεσκίνης καθυστέρησε την εμφάνισητου γηραντικού φαινοτύπου και μείωσε τα επίπεδα TP53, ενώ η σίγαση της ODC1 επιτάχυνε τη γήρανση και αύξησε τη συσσώρευσή της, επιβεβαιώνοντας τον κεντρικό ρόλο του άξονα ODC1–πουτρεσκίνης. Σε μοριακό επίπεδο, ο CDC6 φάνηκε να ρυθμίζει τη βιοσύνθεση πολυαμινών μέσω ενός σηματοδοτικού κυκλώματος που περιλαμβάνειτις ERK, GSK3β και MYC: η πρώιμη ενεργοποίηση της ERK σταθεροποιεί τον MYC, ενώ η παρατεταμένη ενεργοποίηση του CDC6 οδηγεί στην εξαρτώμενη από το GSK3β αποδόμησή του, με συνακόλουθη μείωση της ODC1 και δέσμευση των κυττάρων στη γήρανση. Η εξωγενής πουτρεσκίνη αποκατέστησε τα επίπεδα MYC, ODC1 και pERK, αναδεικνύοντας έναν αναστρέψιμο σηματοδοτικό–μεταβολικό βρόχο. Επιπλέον, ανάλυση δεδομένων single-cell RNA-seq από ασθενείς με COVID-19 έδειξε μειωμένη έκφραση MYC και ODC1 σε κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα με δείκτες γήρανσης, υποδηλώνοντας ότι ο ίδιος άξονας μπορεί να δρα και στο πνευμονικό επιθήλιο υπό συνθήκες στρες. Συμπερασματικά, τα ευρήματα αναδεικνύουν την πουτρεσκίνη ως καθοριστικό μεταβολικό σημείο ελέγχου στη γήρανση που προκαλείται από αντιγραφικό στρες.