Ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα LRF/ZBTB7A στην επιγενετική ρύθμιση του γονιδιώματος

Abstract

The fetal (HbF) to adult (HbA) hemoglobin switch is a subject of research for the therapeutic approach of β-hemoglobinopathies through the reactivation of γ-globin. Transcription factor LRF (Leukemia/lymphoma-related factor), which is encoded by the human ZBTB7A gene, has been shown to play an important role in the process of hemoglobin switch. However, the precise regulatory mechanism and the interaction between transcription factors’ recognition and binding, and epigenetic modifications of chromatin, such as DNA methylation, biochemical modifications of histone tails, and the expression of non-coding RNAs, simultaneously contributing to the regulation of β-globin genes, remain unclear. To study the effect of LRF on the epigenetic regulation of the HbF to HbA switch, stable overexpression and silencing systems of ZBTB7A were constructed. Overexpression was achieved with self-replicating episomal vectors that express the incorporated transgenes extrachromosomally, while silencing was performed with CRISPR/Cas9 genome editing technology, in human erythroleukemic K562 cells in both cases. Although K562 cells originate from an adult patient, they endogenously express fetal hemoglobin at low levels. K562 cells were induced to erythropoiesis with hemin and erythropoietin, during which a simultaneous switch of hemoglobin production from HbF to HbA is observed, making them a suitable model for this study. In addition, transgenic K562 clones were generated capable of overexpressing the epigenetic enzymes DNMT3A (DNA methyltransferase 3A) and HDAC1 (Histone deacetylase 1), in order to evaluate the activity of LRF under conditions of epigenome disruption. The following were performed: construction of recombinant episomal vectors to generate the transgenic K562 clones and then qPCR analyses to assess relative gene expression, pyrosequencing reactions to detect methylation levels at targeted genomic sites, and immunoprecipitation experiments with ChIP-Seq to identify LRF binding sites across the genome, before and after the induction of erythropoiesis. Also, lncRNAs carrying LRF binding sites were identified and further analyzed for their expression and methylation levels across CpG islands in their promoter regions. Finally, the differential expression of miRNAs was studied using NGS technology before and after K562 erythropoiesis induction.Results showed that during hemoglobin switch, LRF binds to the γ globin genes (HBG2/1) and, in cooperation with BCL11A, contributes to the repression of their transcription. LRF also binds to the lncRNA BGLT3 gene, leading to the activation of its expression, which seems to facilitate the switch from γ to β globin expression. During K562 erythropoiesis and hemoglobin switch, LRF displayed strongly elevated binding sites in the genome, >40%, and acted as a repressor of the expression of lncRNAs and miRNAs except for lncRNA DLEU1 and lncRNA BGLT3. Expression levels and methylation status of CpG islands in promoter regions of the lncRNAs studied were not always correlated. Notably, miRNAs located in the same genetic loci as lncRNAs exhibited different expression patterns, suggesting a divergent transcriptional regulatory mechanism. The findings of this study highlight the multilevel regulatory action of LRF on gene expression during the fetal to adult hemoglobin switch and are consistent with the looping model for the developmentally controlled regulation of the β-type globin genes’ expression. The elevated recognition and binding of LRF across the genome observed during erythropoiesis in K562 cells appears to be associated with increased levels of DNA methylation.

Η μεταστροφή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF) στην ενήλικη αιμοσφαιρίνη (HbA) αποτελεί αντικείμενο μελέτης για τη θεραπευτική προσέγγιση των β- αιμοσφαιρινοπαθειών μέσω της επανενεργοποίησης της γ σφαιρίνης. Ο μεταγραφικός παράγοντας LRF (Leukemia/lymphoma-related factor), ο οποίος κωδικοποιείται από το γονίδιο ZBTB7A, έχει αποδειχθεί ότι διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της μεταστροφής των αιμοσφαιρινών. Ωστόσο, ο ακριβής ρυθμιστικός μηχανισμός και η αλληλεπίδραση μεταξύ της δράσης μεταγραφικών παραγόντων και επιγενετικών τροποποιήσεων της χρωματίνης, όπως η μεθυλίωση του DNA, οι βιοχημικές τροποποιήσεις των ιστονικών ουρών και η έκφραση μη κωδικοποιητικών RNAs, τα οποία από κοινού συμβάλλουν στη ρύθμιση των γονιδίων των σφαιρινών τύπου β, παραμένουν ασαφή. Για τη μελέτη της επίδρασης του LRF στην επιγενετική ρύθμιση της διαδικασίας μεταστροφής από την HbF στην HbA, δημιουργήθηκαν συστήματα σταθερής υπερέκφρασης αλλά και αποσιώπησης του ZBTB7A. Η υπερέκφραση επιτεύχθηκε με ειδικούς επισωματικούς φορείς που αυτοαντιγράφονται και εκφράζουν τα διαγονίδια εξωχρωμοσωματικά, ενώ η αποσιώπηση έγινε με τεχνολογία CRISPR/Cas9, σε ανθρώπινα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα K562 και στις δύο περιπτώσεις. Παρόλο που τα κύτταρα Κ562 προέρχονται από ενήλικο ασθενή, εκφράζουν ενδογενώς την εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη σε χαμηλά ποσοστά. Τα κύτταρα K562 υποβλήθηκαν σε επαγωγή ερυθροποίησης με αιμίνη και ερυθροποιητίνη, κατά την οποία παρατηρείται ταυτόχρονη μεταστροφή της παραγωγής αιμοσφαιρίνης από την HbF στην HbA, καθιστώντας τα κατάλληλο μοντέλο για τη συγκεκριμένη μελέτη. Επιπλέον, δημιουργήθηκαν διαγονιδιακοί κλώνοι K562 με υπερέκφραση των επιγενετικών ενζύμων DNMT3A (DNA methyltransferase 3A) και HDAC1 (Histone deacetylase 1) προκειμένου να αξιολογηθεί η δραστικότητα του LRF υπό συνθήκες διαταραχής του επιγονιδιώματος. Πραγματοποιήθηκαν: η κατασκευή ανασυνδυασμένων επισωματικών φορέων για τη δημιουργία των διαγονιδιακών κλώνων Κ562 και στη συνέχεια έγιναν αναλύσεις qPCR για την αξιολόγηση της σχετικής γονιδιακής έκφρασης, αντιδράσεις πυροαλληλούχισης για την ανίχνευση επιπέδων μεθυλίωσης σε στοχευμένες θέσεις του γονιδιώματος και πειράματα ανοσοκατακρήμνισης ChIP-Seq για τον εντοπισμό θέσεων πρόσδεσης του LRF στο γονιδίωμα πριν και μετά την επαγωγή της ερυθροποίησης. Επίσης, ταυτοποιήθηκαν lncRNAs που φέρουν θέσεις πρόσδεσης του LRF και αναλύθηκαν περαιτέρω ως προς τα επίπεδα έκφρασής τους και τα επίπεδα μεθυλίωσης των νησίδων CpG στις περιοχές των υποκινητών τους. Τέλος, μελετήθηκε και η διαφορική έκφραση miRNAs με χρήση τεχνολογίας NGS πριν και μετά την επαγωγή της ερυθροποίησης.Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κατά μεταστροφή των αιμοσφαιρινών, ο LRF προσδένεται στα γονίδια της γ σφαιρίνης (HBG2/1) και, σε συνεργασία με τον BCL11A, συμβάλλει στην καταστολή της μεταγραφής τους. Επίσης, προσδένεται στο γονίδιο του lncRNA BGLT3, οδηγώντας στην ενεργοποίηση της έκφρασής του, η οποία φαίνεται να διευκολύνει τη μεταστροφή της έκφρασης από τη γ στη β σφαιρίνη. Κατά την ερυθροποίηση των Κ562 και την ταυτόχρονη μεταστροφή των αιμοσφαιρινών, ο LRF παρουσίασε αύξηση των σημείων πρόσδεσης στο γονιδίωμα, >40%, και έδρασε κατασταλτικά ως προς την έκφραση των lncRNAs και miRNAs με εξαίρεση τα lncRNA DLEU1 και lncRNA BGLT3. Τα επίπεδα έκφρασης ορισμένων μόνο lncRNAs βρέθηκαν να συσχετίζονται με τα επίπεδα μεθυλίωσης των νησίδων CpG στις περιοχές των υποκινητών τους. Αξιοσημείωτο είναι ότι τα miRNAs που εντοπίζονται στον ίδιο γενετικό τόπο με lncRNAs, εμφάνισαν διαφορετικά πρότυπα έκφρασης, υποδεικνύοντας έναν αποκλίνοντα ρυθμιστικό μηχανισμό μεταγραφής. Τα ευρήματα αυτής της μελέτης αναδεικνύουν την πολυεπίπεδη ρυθμιστική δράση του LRF στην έκφραση γονιδίων κατά τη μεταστροφή της εμβρυϊκής στην ενήλικη αιμοσφαιρίνη και συνάδουν με το μοντέλο του βρόγχου (looping model) για την αναπτυξιακά ελεγχόμενη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών τύπου β. Η αυξημένη πρόσδεση του LRF στο γονιδίωμα που παρατηρείται κατά την ερυθροποίηση φαίνεται να συσχετίζεται με τα αυξημένα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA.