Μοριακοί μηχανισμοί ρύθμισης της αναπτυξιακής ομοιόστασης στο Arabidopsis thaliana

Abstract

Selective proteolysis maintains cellular homeostasis by preventing the accumulation of unfolded or misfolded proteins, which often form deleterious aggregates. Moreover, proteolysis of metabolic enzymes is also an essential regulatory step for various cellular functions. In bacteria and eukaryotic organelles, protein quality control is performed by members of the AAA+ (ATPases Associated with diverse cellular Activities) superfamily. Lon is a highly conserved AAA+ protease essential for organellar homeostasis like mitochondria. However, Lon-mediated mechanisms of substrates selection and recognition remain poorly understood especially in plants. Here, we identify mitochondrial substrates of Arabidopsis Lon1 protease by using a proteolytically inactive Lon1-trap coupled with proteomic analysis. As the genetic background we used lon1-1 plant mutants exhibiting severe growth retardation phenotype, mainly due to mitochondrial dysfunction. The identified substrates participate in key mitochondrial pathways, including energy metabolism, transcription and translation, highlighting the role of Lon1 in maintaining mitochondrial integrity. Notably, we uncover a set of bona fide Lon1 targets susceptible to degradation, including enzymes participating in calcium transport, lipoic acid synthesis, heat shock responses and PentatricoPeptide-Repeat (PPR) proteins, which are key regulators of mitochondrial gene expression. To further investigate the specific targets and processes controlled by Lon1 in plant mitochondria, we performed proteomic and transcriptomic analysis in lon1-1 mutants. Strikingly, PPR proteins involved in mitochondrial RNA splicing and editing are highly overrepresented in the lon1-1 proteome. Consistent with this, the lon1-1 mutant exhibits defects in group II intron splicing and RNA editing, particularly in transcripts encoding Complex I subunits, cytochrome c biogenesis factors, complex IV components and ribosomal proteins. Our findings reveal a novel regulatory role of Lon1 in mitochondrial RNA processing and maturation through the selective proteolytic turnover of PPR proteins.

Η πρωτεόλυση διατηρεί την κυτταρική ομοιόσταση, αποτρέποντας τη συσσώρευση μετουσιωμένων ή λανθασμένα αναδιπλωμένων πρωτεϊνών, οι οποίες συχνά σχηματίζουν επιβλαβή συσσωματώματα. Επιπρόσθετα, η επιλεκτική πρωτεόλυση μεταβολικών ενζύμων είναι αναγκαία ρυθμιστική διεργασία για διάφορες κυτταρικές λειτουργίες. Στα βακτήρια και τα ευκαρυωτικά οργανίδια, ο έλεγχος της ποιότητας των πρωτεϊνών πραγματοποιείται από μέλη της υπερ-οικογένειας AAA+ (ATPases Associated with diverse cellular Activities). Η Lon είναι μια ιδιαίτερα συντηρημένη ΑΑΑ+ πρωτεάση μεταξύ των διάφορων μορφών ζωής, εξαιτίας του καθοριστικού ρόλου της στην διατήρηση της οργανιδιακής ομοιόστασης και κυρίως της λειτουργίας των μιτοχονδρίων. Ωστόσο, οι γνώσεις μας σχετικά με τα πρωτεϊνικά υποστρώματα της Lon ιδίως στα μιτοχόνδρια των φυτών, καθώς και ο μηχανισμός αναγνώρισης τους παραμένουν περιορισμένες. Σε αυτή τη διδακτορική μελέτη, προσδιορίσαμε τα μιτοχονδριακά υποστρώματα της πρωτεάσης Lon1 στο Arabidopsis, χρησιμοποιώντας μια πρωτεολυτικά ανενεργή παραλλαγή Lon1-παγίδας υποστρωμάτων μαζί με πρωτεομική ανάλυση. Ως γενετικό υπόβαθρο χρησιμοποιήθηκαν lon1-1 μεταλλάγματα που εμφανίζουν σοβαρό φαινότυπο καθυστέρησης της ανάπτυξης, κυρίως λόγω της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας. Τα υποστρώματα που εντοπίστηκαν συμμετέχουν σε θεμελιώδεις μιτοχονδριακές διεργασίες, όπως ο ενεργειακός μεταβολισμός, η μεταγραφή και η μετάφραση, αναδεικνύοντας το ρόλο της Lon1 στη διατήρηση της ακεραιότητας των μιτοχονδρίων. Η ανάλυσή μας αποκαλύπτει περαιτέρω μια σειρά από επιβεβαιωμένους στόχους της Lon1, συμπεριλαμβανομένων ενζύμων που συμμετέχουν στη μεταφορά ασβεστίου, στη σύνθεση λιποϊκού οξέος, στις αποκρίσεις θερμικής καταπόνησης αλλά και πρωτεΐνες με επαναλαμβανόμενα μοτίβα τριανταπέντε αμινοξέων (PentatricoPeptide Repeat- PPR), οι οποίες είναι βασικοί ρυθμιστές της έκφρασης των μιτοχονδριακών γονιδίων. Για την περαιτέρω διερεύνηση των εξειδικευμένων στόχων και διεργασιών που ελέγχει η Lon1 στα φυτικά μιτοχόνδρια πραγματοποιήσαμε πρωτεομική και μεταγραφομική ανάλυση στα μεταλλάγματα lon1-1. Πολυάριθμα ένζυμα PPR, μεταξύ των οποίων και γνωστά μέλη που συμμετέχουν στο μάτισμα και την επεξεργασία C/U του μιτοχονδριακού RNA, υπερ-συσσωρεύονται στο πρωτέομα των lon1-1 μεταλλαγμάτων. Σε συμφωνία με αυτό, το μετάλλαγμα lon1-1 εμφανίζει μειωμένη ωρίμανση εσονίων της ομάδας ΙΙ και μεταβολές στην επεξεργασία C/U του RNA, ιδίως σε μεταγραφήματα που κωδικοποιούν υπομονάδες του συμπλόκου Ι, παράγοντες βιογένεσης του κυτοχρώματος c, συστατικά του συμπλέγματος IV και ριβοσωμικές πρωτεΐνες. Συγκεντρωτικά, η μελέτη μας αποκαλύπτει έναν νέο ρυθμιστικό ρόλο της πρωτεάσης Lon1 στην επεξεργασία και ωρίμανση του μιτοχονδριακού RNA μέσω της στοχευμένης πρωτεόλυσης των πρωτεϊνών PPR.