Μηχανισμοί φωτογήρανσης: η επίδραση της UVB ακτινοβολίας στην πρόωρη κυτταρική γήρανση ανθρώπινων δερματικών ινοβλαστών και ανάλυση της φωτοπροστατευτικής ικανότητας φυσικών εκχυλισμάτων της ελληνικής χλωρίδας

Abstract

Ultraviolet B (UVB) radiation is a major contributor to skin photoaging. Although mainly absorbed by the epidermis, 5-10 % of UVB photons manage to penetrate the upper dermis, affecting human dermal fibroblasts (HDFs) and leading, among others, to the accumulation of senescent cells. In vitro studies have shown that repeated exposures to subcytotoxic UVB radiation doses lead to premature senescence of HDFs shortly after the end of the treatment. In this doctoral dissertation, by extending this study over a longer period, we found that repeated exposure to non-cytotoxic doses of UVB radiation, after several days, results in mixed cell cultures consisting of prematurely senescent and UVB-resistant fibroblasts. “Resistant” fibroblasts were more resilient to a novel intense UVB radiation stimulus. RNA-seq analysis revealed that ERCC6, encoding Cockayne syndrome group B (CSB) protein, is up- regulated in resistant HDFs compared to young and senescent cells. CSB was found to be a key molecule conferring protection toward UVB-induced cytotoxicity and senescence, as siRNA-mediated CSB loss-of-expression rendered HDFs significantly more susceptible to a high UVB radiation dose, while cells from a CSB-deficient patient were found to be more sensitive to UVB-mediated toxicity, as well as senescence. UVB-resistant HDFs remained normal (able to undergo replicative senescence) and non-tumorigenic. Being a distinct population in-between young and senescent cells, resistant HDFs retained numerous tissue-impairing characteristics of the senescence-associated secretory phenotype, including increased matrix metalloprotease activity and promotion of epidermoid tumor xenografts in immunodeficient mice. Collectively, here we describe a novel subpopulation of HDFs showing increased resistance to UVB-mediated premature senescence while retaining undesirable traits that may negatively affect skin homeostasis.In the second part of the dissertation, we tested extracts derived from plants of the Greek flora with potential antioxidant, photoprotective (resistance to UVB-mediated cytotoxicity) and anti-aging properties. Specifically, 104 plant extracts and 15 fractions derived from plants of the Greek flora were studied for their cytotoxicity, antioxidant and photoprotective capacity on HDFs and immortalized keratinocytes (HaCaT). Out of the 104 natural extracts, 58 showed strong antioxidant activity in HDFs and 34 in HaCaT cells, while only 6 extracts showed photoprotective effects in HDFs. The plant extract that stood out for its photoprotective effect was isolated from the plant Polygonum Idaeum, 15 fractions of which were studied for their antioxidant and photoprotective capacity. Out of the 15 fractions, 4 showed strong antioxidant activity in HDFs, while 12 showed strong photoprotective capacity, 5 of which showed activity even in the absence of the fraction during HDFs’ irradiation. During this study, we aim to discover new compounds that can be used for the protection of the skin from UVB irradiation and photoaging.

Η υπεριώδης ακτινοβολία Β (UVB) συμβάλλει σημαντικά στη φωτογήρανση του δέρματος. Αν και το μεγαλύτερο ποσοστό της ακτινοβολίας UVB απορροφάται από την επιδερμίδα, 5-10% αυτής καταφέρνει να διεισδύσει στα πρώτα στρώματα της δερμίδας, επηρεάζοντας τους δερματικούς ινοβλάστες και οδηγώντας, μεταξύ άλλων, στην πρόωρη συσσώρευση γηρασμένων κυττάρων στο δέρμα. In vitro μελέτες έχουν δείξει ότι επαναλαμβανόμενες εκθέσεις σε μη κυτταροτοξικές δόσεις ακτινοβολίας UVB οδηγούν σε πρόωρη γήρανση των δερματικών ινοβλαστών λίγες ημέρες μετά το τέλος των επαναλαμβανόμενων εκθέσεων σε ακτινοβολία UVB. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, επεκτείνοντας χρονικά τη μελέτη αυτή, διαπιστώσαμε ότι οι επαναλαμβανόμενες εκθέσεις σε μη κυτταροτοξικές δόσεις ακτινοβολίας UVB μετά από αρκετές ημέρες οδηγούν σε μεικτές καλλιέργειες, αποτελούμενες από πρόωρα γηρασμένους και από ανθεκτικούς (“resistant”) στην ακτινοβολία UVB ινοβλάστες. Οι ανθεκτικοί ινοβλάστες παρουσίασαν μεγαλύτερη αντοχή σε υψηλής δόσης ακτινοβολία UVB, σε σύγκριση με νεαρούς και πρόωρα γηρασμένους ινοβλάστες. Ανάλυση RNA-seq αποκάλυψε ότι ανθεκτικοί ινοβλάστες εμφανίζουν υπερέκφραση του γονιδίου ERCC6, που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη CSB (Cockayne Syndrome group protein B) σε σύγκριση με τους νεαρούς και πρόωρα γηρασμένους ινοβλάστες. Βρέθηκε ότι η CSB είναι ένα βασικό μόριο για την προστασία έναντι της επαγόμενης από την ακτινοβολία UVB κυτταροτοξικότητας και γήρανσης, καθώς η αποσιώπησή της καθιστά τους δερματικούς ινοβλάστες σημαντικά πιο ευαίσθητους στην ακτινοβολίας UVB. Σε συμφωνία με αυτό το εύρημα, κύτταρα από ασθενή που πάσχει από σύνδρομο Cockayne και δεν εκφράζου τη λειτουργική πρωτεΐνη CSB βρέθηκαν να είναι επίσης πιο ευαίσθητα στην ακτινοβολία UVB. Οι ανθεκτικοί ινοβλάστες παρέμειναν φυσιολογικοί αφού διατηρούσαν την ικανότητα αναδιπλασιαστικής γήρανσης και δεν οδηγούσαν σε δημιουργία όγκων όταν ενέθηκαν σε ανοσοκατεσταλμένους μύες. Η ανάλυση RNA-seq έδειξε ότι οι ανθεκτικοί ινοβλάστες αποτελούν έναν διακριτό πληθυσμό ανάμεσα στους νεαρούς και τους πρόωρα γηρασμένους ινοβλάστες, και διατηρούν αρκετά χαρακτηριστικά του εκκριτικού φαινοτύπου των γηρασμένων κυττάρων (Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP), όπως η υπερέκφραση των μεταλλοπρωτεασών (MMPs), επηρεάζοντας έτσι την ιστική ομοιοστασία, και την προώθηση της ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων σε ανοσοκατεσταλμένους μύες. Συνοπτικά, στην παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφουμε για πρώτη φορά έναν υποπληθυσμό δερματικών ινοβλαστών που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη CSB, οι οποίοι παρουσιάζουν ανθεκτικότητα στη γήρανση που προκαλείται από την ακτινοβολία UVB, διατηρώντας παράλληλα χαρακτηριστικά που μπορεί να επηρεάζουν αρνητικά την ομοιοστασία του δέρματος. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής πραγματοποιήθηκε η μελέτη εκχυλισμάτων από φυτά της ελληνικής χλωρίδας με πιθανή αντιοξειδωτική, φωτοπροστατευτική και τελικά αντιγηραντική δράση. Συγκεκριμένα μελετήθηκαν 104 φυσικά εκχυλίσματα και 15 κλάσματα που προήλθαν από φυτά της ελληνικής χλωρίδας ως προς την κυτταροτοξικότητα, την αντιοξειδωτική και τη φωτοπροστατευτική τους δράση σε ανθρώπινους δερματικούς ινοβλάστες και αθανατοποιημένα κερατινοκύτταρα. Από τα 104 εκχυλίσματα, 58 παρουσίασαν ισχυρή αντιοξειδωτική δράση σε δερματικούς ινοβλάστες και 34 σε αθανατοποιημένα κερατινοκύτταρα, ενώ μόλις 6 εκχυλίσματα παρουσίασαν φωτοπροστατευτική δράση μόνο σε δερματικούς ινοβλάστες. Το φυτικό εκχύλισμα που ξεχώρισε για τη φωτοπροστατευτική του δράση απομονώθηκε από το φυτό Polygonum Idaeum, από το οποίο μελετήθηκαν 15 κλάσματα από το φυτό αυτό ως προς τις αντιοξειδωτικές και φωτοπροστατευτικές τους ιδιότητες. Από τα 15 κλάσματα τα 4 παρουσίασαν ισχυρή αντιοξειδωτική δράση σε δερματικούς ινοβλάστες, ενώ 12 παρουσίασαν ισχυρή φωτοπροστατευτική δράση με τα 5 να παρουσιάζουν δράση και απουσία του κλάσματος κατά την ακτινοβόληση των δερματικών ινοβλαστών. Από τη μελέτη αυτή ελπίζουμε να οδηγηθούμε στην εξεύρεση νέων ενώσεων που θα χρησιμοποιηθούν για την προστασία του δέρματος από την ακτινοβολία UVB και τη φωτογήρανση.