Μελέτη των κυκλινών και των αναστολέων των κυκλινών εξαρτώμενων κινασών ως βιοδείκτες για την πρόγνωση σε ασθενείς με μελάνωμα του δέρματος

Abstract

The increasing incidence of cutaneous melanoma (CM) worldwide, combined with the observed higher mortality risk compared with other skin cancers, render the accurate diagnosis, prognosis and treatment of this malignancy of outmost importance. A variety of genetic and environmental factors have been incriminated for the malignant transformation of melanocytes, but, despite the novel advances in molecular analysis, genomics and cancer biology technologies, we are far away from completely elucidating the molecular mechanisms, responsible for inhibition of apoptosis and tumor suppressor inactivation, which lead to pathogenesis and progression of CM. As a consequence, CM still remains an unpredictable disease, and the accuracy of the traditional melanoma staging system appears not sufficient in predicting patients’ individual risk of disease recurrence and mortality. More precisely, patients suffering from locoregional melanoma of the same stage may present a totally different disease course and suboptimal adjuvant treatment may be offered. Thus, it is extremely important to develop additional prognostic tools in order to achieve optimal stratification of patients into risk subgroups and for earlier identification of individuals at high risk for recurrence. Through that process, personalized treatment of patients with CM could be offered, resulting in improved outcomes by treating more effectively high risk patients, providing less unnecessary adjuvant treatments in low risk patients and, hence, potentially diminishing healthcare costs. Cyclins and cyclin-dependent kinase inhibitors, which are key players in the cell cycle regulation, have attracted great interest in the field of melanomagenesis. Herein, it is important to examine their expression and prognostic value. The goals of this study were to investigate the expression of Cyclin D1, Cyclin E, p16, p21 and p27 in primary invasive CM, to assess their correlation with clinicopathological variables and to evaluate their potential role as prognostic biomarkers. The expression of proteins was assessed using immunohistochemistry in the primary tumors of 59 consecutive patients diagnosed with locoregional CM after diagnostic excisional biopsy and when indicated sentinel node biopsy or lymph node dissection. The population of the study was selected using certain criteria from a newly constructed database containing all melanoma patients treated in the Department of Surgical Oncology of the University Hospital of Heraklion from 2000 up to date. Patients with distant metastases at diagnosis, those with a follow-up period of less than five years and those referred with a diagnostic biopsy performed elsewhere were not included in the study. Subsequently, wide local excision, sentinel lymph node biopsy and/or regional lymph node dissection and adjuvant treatment were applied according to the international guidelines. The immunostaining of sections was analyzed using a semiquantitative process based on proportion of tumor cells showing unequivocal positive reaction. In the cases of Cyclin D1, p21 and p27 only nuclear staining was reported. To the contrary, nuclear and cytoplasmic staining was graded separately for p16 and Cyclin E. The reproducibility of the process was guaranteed by defining clear cut-off criteria for each marker based on the endogenous expression of proteins in non-tumoral cells. The analysis of our data revealed positive association between the concentration of Cyclin E in nucleus and tumor thickness (p=0.017). An opposite pattern of interaction was found for p16. The level of nuclear p16 expression was inversely proportional with Breslow thickness (p=0.001) and ulceration (p=0.035), whereas low expression of p16 in the cytoplasm was only associated with thicker melanoma (p=0.004). Beyond the relationship with certain clinicopathological variables, the high expression of Cyclin E in nucleus and the loss of p16 in cytoplasm and nucleus were associated with shorter overall survival (p<0.001, p=0.012 and p=0.002, respectively). Similarly, shorter relapse free survival was significantly related to absence of p16 from cytoplasm and nucleus (p=0.011 and p=0.002, respectively), and elevated expression of Cyclin E in nucleus (p<0.001). Interestingly, Cyclin E proved to be a prognostic factor for survival parameters, as strong as Breslow thickness, which is known as the strongest prognostic factor in clinically localized CM. Larger studies should confirm the definite prognostic value of p16 and Cyclin E in CM and assess whether indeed Cyclin E might be a prognostic biomarker even stronger than Breslow thickness. Moreover, subgroup analysis in larger cohorts should assess the prognostic value of p16 and Cyclin E in various invasive depths and nodal stages, allowing for more optimal risk stratification than the current TNM system, and subsequently for optimal adjuvant treatment. Beyond assessing the prognostic roles of these cell cycle regulators individually, these biomarkers that identify more aggressive disease may also be useful as targets for precision medicine in the future.

Το μελάνωμα του δέρματος είναι κακόηθες νεόπλασμα, το οποίο εξορμάται από τα κύτταρα που είναι υπεύθυνα για τη παραγωγή μελανίνης (μελανινοκύτταρα) και θεωρείται το αποτέλεσμα αλληλεπιδράσεων μεταξύ γενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων που οδηγούν σε κρίσιμες μεταβολές σε κυτταρικά μονοπάτια, τα οποία ελέγχουν τις λειτουργίες του πολλαπλασιασμού και της απόπτωσης. Η επίπτωση του μελανώματος του δέρματος στο γενικό πληθυσμό παγκοσμίως αυξάνεται κατά 3% κάθε χρόνο, καθιστώντας το ως τη 17η πιο συχνή κακοήθεια με 330.000 νέα περιστατικά το χρόνο και την 22η πιο θανατηφόρα νεοπλασία με έναν ετήσιο αριθμό θανάτων ο οποίος προσεγγίζει τις 60.000. Παρά τη πρόοδο της τεχνολογίας στους τομείς της μοριακής βιολογίας, της βιοτεχνολογίας και της γενετικής μηχανικής, το μελάνωμα παραμένει απρόβλεπτο ως προς τη βιολογική του συμπεριφορά και μελέτες ευρείας κλίμακας έχουν δείξει, ότι οι κλινικο-παθαλογοανατομικοί προγνωστικοί παράμετροι που χρησιμοποιούνται σήμερα για την εκτίμηση του κινδύνου υποτροπής και θανάτου, αδυνατούν να προβλέψουν ικανοποιητικά τυχόν παρέκκλιση στην αναμενόμενη πορεία των ασθενών, και κατ’ επέκταση, να αντικατοπτρίσουν με ακρίβεια στο σύνολο των περιστατικών τη παρατηρούμενη στη κλινική πράξη έκβαση. Επιπλέον, σε ένα μεγάλο ποσοστό ασθενών δεν χορηγείται συμπληρωματική συστηματική θεραπεία, λόγω της δυσμενούς ή άγνωστης σχέσης μεταξύ κινδύνου-οφέλους, οπότε, υπάρχει κατά την αρχική διάγνωση μεγάλη ανάγκη ανίχνευσης της ομάδας ασθενών με αυξημένο κίνδυνο υποτροπής προκειμένου να υποβληθεί σε μετεγχειρητική αγωγή. Μέσω μιας αρτιότερης κατηγοριοποίησης των περιστατικών, θα ήταν εφικτή η επίτευξη εξατομικευμένης θεραπευτικής αντιμετώπισης, με όφελος τόσο από τη χορήγηση συμπληρωματικής θεραπείας στους ασθενείς υψηλού κινδύνου για υποτροπή όσο και από την αποφυγή μη απαραίτητων ιατρικών παρεμβάσεων στους ασθενείς χαμηλού κινδύνου για τους οποίους η συστηματική παρακολούθηση θα αναδεικνυόταν ως ο ενδεδειγμένος τρόπος διαχείρισης. Μια τέτοια διαδικασία πιθανά να οδηγούσε, τελικά, και σε μείωση του ετήσιου κόστους υγειονομικής περίθαλψης. Είναι εμφανής η ανάγκη ανεύρεσης αξιόπιστων βιοδεικτών για τη πρόγνωση στο μελάνωμα δέρματος και η έρευνα επικεντρώνεται σε μεγάλο βαθμό στα βιολογικά μόρια που διαδραματίζουν καίριο ρόλο στην ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου των μελανινοκυττάρων. Προς αυτή τη κατεύθυνση, ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν διττός. Πρώτος στόχος ήταν ο προσδιορισμός της έκφρασης των κυκλινών D1 και E, και των αναστολέων των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών p16, p21 και p27 σε πρωτοπαθή διηθητικά μελανώματα δέρματος και η αναζήτηση πιθανής συσχέτισης με κλινικο-παθολογοανατομικές μεταβλητές. Δεύτερη επιδίωξη ήταν η ανίχνευση της επίδρασης αυτών των πρωτεϊνών στην κλινική πορεία των ασθενών και ο καθορισμός της αξίας τους ως υποψήφιων προγνωστικών βιοδεικτών. Βασική προϋπόθεση για την εκπλήρωση των στόχων της μελέτης ήταν η εκπόνηση και η εφαρμογή ενός οργανωμένου ερευνητικού πρωτοκόλλου. Στο πλαίσιο αυτό, η ανάπτυξη βάσης πληροφοριών, για τη καταχώρηση δεδομένων στο σύνολο των περιστατικών μελανώματος της Κλινικής Χειρουργικής Ογκολογίας του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Ηρακλείου, αποτέλεσε το αρχικό και καθοριστικό βήμα. Η υλοποίηση αυτής της συνθήκης έδωσε τη δυνατότητα εφαρμογής αυστηρών κριτηρίων επιλογής για το καθορισμό της ομάδας ασθενών, στην οποία θα ελάμβανε χώρα η μελέτη των αναφερόμενων πρωτεϊνών. Πιο συγκεκριμένα, συμπεριλήφθηκαν ασθενείς χωρίς απομακρυσμένες μεταστάσεις από τον κλινικο-απεικονιστικό έλεγχο κατά την αρχική διάγνωση, με τουλάχιστον πέντε έτη παρακολούθησης και με ιστολογική έκθεση ενδεικτική της ύπαρξης κακόηθειας από το Εργαστήριο Παθολογικής Ανατομίας του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Ηρακλείου. Επίσης, περιστατικά στα οποία η διαγνωστική βιοψία δεν είχε πραγματοποιηθεί στη Κλινική της Χειρουργικής Ογκολογίας του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Ηρακλείου αποκλείστηκαν από την έρευνα. Με αυτό τον τρόπο καθορίστηκε το δείγμα της μελέτης, το οποίο περιελάμβανε 59 άτομα. Η εγκυρότητα της μελέτης διασφαλίστηκε τόσο με την εφαρμογή των διεθνών κατευθυντήριων οδηγιών στη διάγνωση, αντιμετώπιση και παρακολούθηση των περιστατικών όσο και με τη συνεχή ενημέρωση των στοιχείων της βάσης δεδομένων. Σε υλικό του πρωτοπαθούς όγκου των επιλεγμένων ασθενών πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Παθολογικής Ανατομίας του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Ηρακλείου ανοσοϊστοχημικός έλεγχος για το ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό της παρουσίας των πρωτεϊνών με βάση το ποσοστό της θετικής χρώσης των κυττάρων. Στις περιπτώσεις της κυκλίνης D1 και των αναστολέων των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών p21 και p27 μόνο η χρώση των πυρήνων των κυττάρων αξιολογήθηκε ως θετική έκφραση. Απεναντίας, στις πρωτεΐνες κυκλίνη E και p16, η πυρηνική και η κυτταροπλασματική σήμανση εκτιμήθηκαν χωριστά. Η ορθότητα της πειραματικής διαδικασίας διασφαλίστηκε με την υιοθέτηση ορίων θετικότητας για κάθε πρωτεΐνη, όπως αυτά ορίζονται από την ενδογενή παρουσία των μορίων σε μη καρκινικούς ιστούς. Η στατιστική ανάλυση που ακολούθησε αποκάλυψε σημαντική συσχέτιση μεταξύ του αυξημένου βάθους διήθησης κατά Breslow και της χαμηλής έκφρασης του αναστολέα p16 (p=0,004 για το κυτταρόπλασμα και p=0,001 για το πυρήνα), ενώ και η παρουσία εξέλκωσης συνδέθηκε στενά με τα χαμηλά επίπεδα της πρωτείνης στο πυρήνα (p=0,035). Επιπλέον, η χαμηλή έκφραση του αναστολέα p16 σχετίστηκε με αυξημένο κίνδυνο λεμφαδενικής μετάστασης (p=0,001 για το πυρήνα), μεγαλύτερο κίνδυνο θανάτου από το μελάνωμα (p=0,046 για το κυτταρόπλασμα και p=0,025 για το πυρήνα), μειωμένο διάστημα ελεύθερο νόσου (p=0,011 για το κυτταρόπλασμα και p=0,002 για το πυρήνα) και μικρότερη συνολική επιβίωση των ασθενών (p=0,012 για το κυτταρόπλασμα και p=0,002 για το πυρήνα). Αντιθέτως, η αυξημένη έκφραση της κυκλίνης Ε στο πυρήνα συσχετίστηκε με αυξημένο πάχος κατά Breslow (p=0,017), αυξημένη πιθανότητα ύπαρξης διηθημένων λεμφαδένων (p=0,004) και υψηλό κίνδυνο θανάτου από το μελάνωμα (p=0,001). Επιπροσθέτως, τα υψηλά πυρηνικά επίπεδα της πρωτεΐνης συνδέθηκαν στενά τόσο με μικρότερη επιβίωση ελεύθερη νόσου (p<0,001) όσο και με μειωμένη συνολική επιβίωση των ασθενών (p<0,001). Μάλιστα, η σύνδεση αυτών των δυο χρονικών μεταβλητών με τη έκφραση της πρωτεΐνης ήταν εξίσου ισχυρή, αν όχι ισχυρότερη, με την αντίστοιχη που υπάρχει με το πάχος κατά Breslow, ο οποίος είναι ο πιο γνωστός και αξιόπιστος προγνωστικός δείκτης στο κλινικά εντοπισμένο μελάνωμα δέρματος. Η διενέργεια επιπρόσθετων μελετών ευρείας κλίμακας είναι απαραίτητη, τόσο για την επιβεβαίωση της ακριβούς προγνωστικής αξίας της κυκλίνης Ε και του p16 όσο και για τη διερεύνηση της σχέσης αυτών των πρωτεϊνών στις υποομάδες του υπάρχοντος σύστημα σταδιοποίησης, προκειμένου να επιτευχθεί μελλοντικά αρτιότερη κατηγοριοποίηση των ασθενών, ορθότερη επιλογή των περιστατικών προς συμπληρωματική συστηματική θεραπεία, μείωση του κόστους υγειονομικής περίθαλψης και ενδεχομένως ανάπτυξη στοχευμένων θεραπειών.