Μοριακά δίκτυα δυνητικών stem κυττάρων στο κακοήθες μελάνωμα του δέρματος

Abstract

Background. Cutaneous malignant melanoma originates from melanocytes and is characterized by constantly growing incidence and mortality rates world-wide. The substantial unresponsiveness of advanced metastatic melanomas to most forms of chemotherapy and radiation indicates an urgent need for more effective agents to overcome chemoresistance. The field of cancer systems biology has emerged to address the increasing challenge of cancer as a complex, multifactorial disease using sophisticated model-based approaches. Accumulating evidence strongly suggests the presence and involvement of cancer cells with stem cell-like properties (CSCs) in the initiation, progression and metastasis of malignant melanoma. The emerging concept of cell plasticity and reciprocity (to change the phenotype by processing signals from the environment) throws more light on the actual complexity of tumor heterogeneity. The discovery that the epithelial to mesenchymal transition (EMT) generates cells with stem cell-like properties and a more invasive and metastatic phenotype, brings a connection between metastasis and the stem-cell state. According to this model, cells with stem cell properties are located predominantly at the tumor invasion front (IF) and can derive through the acquisition of transient EMT phenotype. SOX2 and Oct4 represent crucial components of the reciprocal regulatory circuit that controls stemness. The misregulation of epigenetic modifications, such as H3K4me2 and H3K27me3 which constitute stem cell-like "bivalent" domains, have been also identified to possess a crucial role in carcinogenesis. Polycomb-group proteins proteins and mainly EZH2 are responsible for maintaining the balance of the bivalent chromatin domain through the methylation of H3K27. Purpose. Taking these data into account, we performed the current study in order to evaluate the immunohistochemical expression of EZH2, SOX2 and Oct4 as well as H3K4me2 and H3K27me3, which constitute stem cell-like "bivalent"domains, in cutaneous malignant melanoma, investigating besides the potential identification of cancer cells with stem cells properties at the invasion front of the tumor. Materials and methods. Expression of EZH2, SOX2, Oct4, H3K4me2 and H3K27me3 was evaluated in 89 malignant melanoma (MM) lesions, deriving from 79 patients, using immunohistochemistry, on formalin-fixed paraffin-embedded tissue sections. The analyzed cases were accessioned over the time interval 2001- 2010 and retrieved from an electronic database maintained by the Department of Pathology of the University General Hospital of Patras (Rion, Greece). 14 specimens contained both melanoma cells and nevus cells. Analysis and comparative studies were carried out on the expression of the proteins tested in melanoma cells, nevus cells (where existed), and keratinocytes. In cases where staining was heterogeneous, as at the tumor IF, immunostaining was evaluated both for the inner tumor mass and241the IF. Polymer based technique (Envision, Dako, USA) or MACH4 Universal HRP-Polymer Detection (Biocare Medical, USA) and primary antibodies against EZH2 (Novocastra Laboratories Ltd, UK), SOX2 (R&D Systems, Inc.), Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc), H3K4me2 (Cell Signaling Technology, USA) and H3K27me3 (Cell Signaling Technology, USA) were used. In each case, the percentage of cells exhibiting positive staining was determined. Cell counts were performed at a 400X magnification. Data were analyzed using the SPSS statistical package (SPSS©, Release 19.0). The level of significance was set at p-value < 0.05.Results.EZH2, H3K4me2 and H3K27me3 were identified in the cell nuclei of melanoma cells, nevus cells and epidermal keratinocytes, while the stemness markers SOX2 και Oct4 showed, in contrast to previous studies, nuclear and cytoplasmic expression. In general, a specific distribution pattern of H3K4me2 and H3K27me3 was found, as stronger levels were localized at the tumor IF compared to the inner tumor mass(p=0.035 and p<0.010 respectively). A similar trend was also observed for EZH2, without achieving however statistical significance (p=0.080), and similarly for SOX2 in a few sporadic cases. Statistical analysis further revealed significantly higher expression of EZH2 in melanoma cells compared to nevus cells, while nuclear SOX2 and Oct4 expression was found increased in nevus compared to melanoma cells (p=0.003 and p=0.004 respectively). H3K4me2 and H3K27me3 nuclear levels presented significantly higher values in primary with respect to metastatic melanoma lesions (p=0.006 and p=0.030 respectively). Advanced melanoma demonstrated significantly lower H3K4me2 expression than did cases of lowest Clark level (I) or low Breslow depth (p=0.040 and p<0.001 respectively). As far as nuclear expression of Sox2 is concerned, its nuclear LIs in melanoma cells presented significantly higher values in primary compared to metastatic malignant melanoma lesions (p=0.045) as well as in melanoma cells with low Breslow’s depth (≤1mm) (p=0.045), in the absence of ulceration (p=0.010) and with low (≤6/mm2) mitotic rate (p=0.015). A significant difference between the LIs in melanoma cells under the presence or absence of lymphocytic infiltration was found, as lymphocytic infiltration was associated with significantly expression of EZH2 in melanoma cells (p=0.015). Finally, statistical analysis further revealed a positive correlation in melanoma cells between expression levels of EZH2 and H3K27me3 (p=0.030), H3K4me2 and H3K27me3 (p<0.010), Oct4 and SOX2 (p<0.001), SOX2 and H3K4me2 (p=0.005) as well as Oct4 and H3K27me3(p=0.004). Conclusions.Our results suggest the possibility that combined immunohistochemical expression of EZH2, SOX2, Oct4, H3K4me2 and H3K27me3 might identify cancer cells with potential stem cell properties, particularly at the invasion front of this malignancy. Moreover, these factors may play an important role in the pathogenesis of cutaneous malignant melanoma. These hypotheses should be further investigated, as many of the epigenetic changes are reversible via pharmacologic manipulations and new CSC-directed therapies, overpassing the resistance of advanced melanoma, may be developed.

Εισαγωγή.Το κακόηθες μελάνωμα του δέρματος αποτελεί την πιο επιθετική μορφή καρκίνου του δέρματος και είναι ένα από τα επιθετικότερα κακοήθη νεοπλάσματα, με συνεχώς αυξανόμενη συχνότητα. Η αξιοσημείωτη αντοχή που επιδεικνύει το μεταστατικό μελάνωμα στην τρέχουσα θεραπευτική αντιμετώπιση, επιβάλλει τον σχεδιασμό νέων, πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών προσεγγίσεων. Ο καρκίνος θεωρείται σήμερα ένα πολύπλοκο Βιολογικό Σύστημα. Υπό αυτό το πρίσμα η κατανόηση της λειτουργίας των δυναμικών παθοβιολογικών Δικτύων στο κακόηθες μελάνωμα του δέρματος, προϋποθέτει την εφαρμογή στρατηγικών Συστημικής Προσέγγισης. Σύμφωνα με το μοντέλο των Καρκινικών Stem Κυττάρων (CSCs), μόνο ένα υποσύνολο καρκινικών κυττάρων που εμφανίζει τα μοναδικά χαρακτηριστικά των Stem Κυττάρων, αυτοανανέωση και πολυδυναμία, είναι ογκογόνο. Επιπλέον, είναι καλά τεκμηριωμένο, ότι η ενεργοποίηση του προγράμματος της Επιθηλιο- Μεσεγχυματικής Μετάβασης (ΕΜΤ) προσδίδει στα καρκινικά κύτταρα ιδιότητες stem κυττάρων. Νεώτερα δεδομένα εισηγούνται, ότι τα καρκινικά stem κύτταρα του όγκου που προκύπτουν μέσω της επιθηλιο-μεσεγχυματικής-μετάβασης (ΕΜΤ), εντοπίζονται αρχικά στη διηθητική παρυφή του όγκου και χαρακτηρίζονται από πλαστικότητα, με εναλλαγές μεταξύ επιθηλιακού και μεσεγχυματικού φαινότυπου. Καίριοι εκπρόσωποι του αυτορρυθμιστικού δικτύου του stemness (ιδιότητες αυτοανανέωσης, πολυδυναμίας) είναι οι homedomain μεταγραφικοί παράγοντες SOX2 και Oct4, ενώ είναι πλέον καλά τεκμηριωμένη η σπουδαιότητα της διασυνομιλίας τους (cross-talk) με επιγενετικούς παράγοντες ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης. Στους τελευταίους περιλαμβάνεται η μεθυλοτρανσφεράση EZH2, μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών Polycomb (PcG), και οι επιγενετικές τροποποιήσεις H3K4me2 και H3K27me3, η «αντιμαχόμενη» δράση των οποίων (χρωματίνη σε κατάσταση ισορροπίας–με διττό δυναμικό, bivalent domain) συνιστά έναν σημαντικό επιγενετικό μηχανισμό ελέγχου γονιδίων stem κυττάρων. Σε αυτό το πλαίσιο, παρουσιάζει εξαιρετικό ενδιαφέρον η μορφολογική εκτίμηση, στο κακόηθες μελάνωμα του δέρματος, της έκφρασης γνωστών παραγόντων που σχετίζονται με τα stem κύτταρα, αφού η μορφολογική προσέγγιση επιτρέπει την εκτίμηση και της διηθητικής παρυφής της υπό μελέτη επεξεργασίας.Σκοπός.Η παρούσα διδακτορική διατριβή, υπό το πρίσμα της συστημικής προσέγγισης, αφορά την μορφολογική - ανοσοϊστοχημική μελέτη στο κακόηθες μελάνωμα, των δυνητικών δεικτών καρκινικών stem κυττάρων SOX2, Oct4, EZH2, Η3Κ4me2 και H3K27me3, και διερευνά τον ρόλο τους στη παθογένεια του κακοήθους μελανώματος του δέρματος.Υλικό και μέθοδος.Με τη μορφολογική μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας εκτιμήθηκε το μέσο ποσοστό (LI%) έκφρασης των υπό μελέτη δεικτών σε 89 δείγματα ιστών από 79 ασθενείς με κακόηθες μελάνωμα του δέρματος. Για την επιλογή των κατάλληλων δειγμάτων έγινε ανασκόπηση των αρχείων του εργαστηρίου238Παθολογικής Ανατομικής του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Πατρών των ετών 2001 έως 2010. Σε 14 δείγματα συνυπήρχαν κύτταρα σπίλου και μελανώματος. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε το σύστημα ανίχνευσης EnVision (Envision, Dako, USA) ή MACH4 Universal HRP-Polymer Detection (Biocare Medical, USA) και πρωτογενή αντισώματα έναντι των EZH2 (Novocastra Laboratories Ltd, UK), H3K4me2 (Cell Signaling Technology, USA), H3K27me3 (Cell Signaling Technology, USA), SOX2 (R&D Systems, Inc.) και Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc). Σε κάθε ιστικό δείγμα και για κάθε δείκτη εκτιμήθηκε με το φωτονικό μικροσκόπιο το μέσο ποσοστό των κυττάρων που εμφάνιζαν θετική ανοσοχρώση (Labeling Index, LI%). Επιπλέον, έγινε συγκριτική μελέτη της έκφρασης των υπό μελέτη δεικτών στα κύτταρα μελανώματος της διηθητικής παρυφής σε σχέση με την κυρίως μάζα του όγκου. Η καταμέτρηση των θετικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε μεγάλης μεγέθυνσης πεδίο (400X). Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του SPSS στατιστικού πακέτου (SPSS©, Release 19.0). Τιμές p<0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές. Αποτελέσματα.Στο κακόηθες μελάνωμα του δέρματος ταυτοποιήθηκε η παρουσία των υπό μελέτη δεικτών SOX2, Oct4, EZH2, H3K4me2 και H3K27me3, σε άλλοτε άλλο βαθμό. Πυρηνική ανοσοχρώση ανιχνεύθηκε για τους επιγενετικούς δείκτες EZH2, H3K4me2 και H3K27me3, ενώ για τους homedomain παράγοντες SOX2 και Oct4 παρατηρήθηκε πυρηνική και κυτταροπλασματική έκφραση, η οποία μελετήθηκε ξεχωριστά. Σημαντικό εύρημα της παρούσας διατριβής ήταν το ανομοιογενές προφίλ ανοσοθετικότητας, με σημαντικά αυξημένο μέσο ποσοστό (LI%) κυττάρων μελανώματος με έκφραση των επιγενετικών τροποποιήσεων H3K4me2 και H3K27me3 στη διηθητική παρυφή σε σχέση με την κυρίως μάζα του όγκου (p=0.035 και p<0.010 αντίστοιχα). Αντίστοιχη τάση για αυξημένη έκφραση έδειξε και ο παράγων EZH2, χωρίς όμως αυτό το εύρημα να αποδειχθεί στατιστικά σημαντικό (p=0.080), ενώ ανάλογη τάση παρατηρήθηκε σε μικρό αριθμό περιπτώσεων κατά την μελέτη του μεταγραφικού παράγοντα SOX2. Αυξημένα επίπεδα του επιγενετικού παράγοντα ΕΖΗ2 διαπιστώθηκαν στα κύτταρα μελανώματος σε σχέση με τα κύτταρα σπίλου (p=0.020), ενώ, τα επίπεδα πυρηνικής έκφρασης των homedomain μεταγραφικών παραγόντων SOX2 και Oct4 βρέθηκαν αυξημένα στα κύτταρα σπίλου σε σχέση με τα κύτταρα μελανώματος (p=0.003 και p=0.004 αντίστοιχα). Το μέσο ποσοστό πυρηνικής έκφρασης SOX2 και κυτταροπλασματικής έκφραση Oct4 ήταν αυξημένο στα πρωτοπαθή σε σχέση με τα μεταστατικά μελανώματα (p=0.045 και p=0.025 αντίστοιχα). Αυξημένη επίσης έκφραση στα πρωτοπαθή σε σχέση με τα μεταστατικά μελανώματα διαπιστώθηκε για τους επιγενετικούς δείκτες H3K4me2 και H3K27me3 (p=0.006 και p=0.030 αντίστοιχα). Η διερεύνηση της σχέσης των υπό μελέτη δεικτών με τα επί μέρους κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά του νεοπλάσματος, έδειξε αυξημένη έκφραση του πυρηνικού SOX2 και του H3K4me2 στα μελανώματα με μικρό πάχος όγκου(<1mm) κατά Breslow (p=0.045 και p< 0.001 αντίστοιχα), και αυξημένη έκφραση του H3K4me2 σε μελανώματα με μικρό επίπεδο διήθησης (Ι) κατά Clark (p=0.040), σε σχέση με νεοπλάσματα με μεγαλύτερο βαθμό διήθησης. Διαπιστώθηκε επίσης αυξημένη έκφραση του πυρηνικού SOX2 και του δείκτη H3K27me3239σε επεξεργασίες με χαμηλό αριθμό (≤6/mm2) μιτώσεων (p=0.015 και p=0.025 αντίστοιχα). Το μέσο ποσοστό έκφρασης των δεικτών SOX2 (πυρηνική), Oct4 (κυτταροπλασματική), H3K4me2 και H3K27me3 ήταν αυξημένο σε μελανώματα χωρίς εξέλκωση σε σχέση με αυτά που ενεφάνιζαν εξέλκωση (p=0.010, p=0.020, p<0.001, p=0.045 αντίστοιχα). Τέλος διαπιστώθηκε αυξημένη έκφραση των επιγενετικών παραγόντων ΕΖΗ2 και H3K27me3 σε μελανώματα με παρουσία λεμφοκυτταρικής διήθησης σε σχέση με αυτά χωρίς λεμφοκυτταρική διήθηση (p=0.010). Η διερεύνηση της πιθανής συσχέτισης της έκφρασης των υπό μελέτη πέντε δυνητικών δεικτών καρκινικών stem κυττάρων SOX2, Oct4, EZH2, Η3Κ4me2 και H3K27me3 μεταξύ τους, στα κύτταρα του κακοήθους μελανώματος, έδειξε τα εξής: Θετική συσχέτιση μεταξύ των μεταγραφικών παραγόντων SOX2 και Oct4 τόσο για την πυρηνική (p<0.001) όσο και για την κυτταροπλασματική έκφρασή τους (p<0.001). Θετική συσχέτιση μεταξύ της παρουσίας της επιγενετικής τροποποίησης H3K27me3 με την έκφραση της μεθυλοτρανσφεράσης EZH2 (p=0.030), καθώς επίσης και με την πυρηνική (p=0.010) και κυτταροπλασματική έκφραση του Oct4 (p=0.004). Θετική συσχέτιση της επιγενετικής τροποποίησης H3K4me2 με την πυρηνική έκφραση του SOX2 (p=0.005). Θετική συσχέτιση μεταξύ των δύο επιγενετικών τροποποιήσεων H3K4me2 και H3K27me3 στα κύτταρα μελανώματος (p<0.010).Συμπεράσματα.Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης εισηγούνται ότι οι επιγενετικοί δείκτες H3K4me2, H3K27me3 και ΕΖΗ2 και οι homedomain μεταγραφικοί παράγοντες SOX2 και Oct4, αποτελούν δείκτες εν δυνάμει καρκινικών stem κυττάρων στο κακόηθες μελάνωμα του δέρματος, και ιδιαίτερα στην διηθητική παρυφή της επιθετικής κακοήθους αυτής επεξεργασίας. Επιπλέον, εισηγούνται ότι οι 5 υπό μελέτη δείκτες ενέχονται στην παθογένεια του κακοήθους μελανώματος του δέρματος. Αυτές οι υποθέσεις πρέπει να διερευνηθούν περαιτέρω, καθώς αναδύεται η προοπτική εισαγωγής στη καθημερινή κλινική πράξη νέων, πιο αποτελεσματικών διαγνωστικών μεθόδων και επιλεκτικών θεραπευτικών παρεμβάσεων στο επιγενετικό status των κυττάρων μελανώματος, αλλά και γενικότερα των καρκινικών κυττάρων, η οποία προϋποθέτει την περαιτέρω κατανόηση, στα πλαίσια της συστημικής προσέγγισης, των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την καρκινογένεση.