Βιολογικές εφαρμογές νανοϋλικών για τη διάγνωση και αντιμετώπιση διαταραχών του μεταβολισμού της γλυκόζης

Abstract

Diabetes Mellitus (DM) is a chronic metabolic disorder characterized by impaired glucose homeostatic regulation in the body. Over the last decades, DM has reached epidemic levels worldwide. According to the International Diabetes Federation it is estimated that approximately 538 million adults are living with diabetes and this number is projected to rise to 783 million by 2045. DM has become one of the major public health issues, significantly impacting the socio- economic development of each country. The evolution of Nanotechnology brought hope for achieving effective management of DM. The development of continuous glucose monitoring systems as well as insulin pumps, significantly reduced the episodes of hypo- and hyper- glycemia and improved the quality of life of diabetics. However, there is still room for improvement, and efforts are now being made to develop new systems for detecting glucose levels and administering therapeutic treatment. Specifically, research aims at developing non-invasive “closed- loop” systems for diabetes management, which will not only provide continuous glucose monitoring but also release the appropriate therapeutic agent when it is necessary. These systems will significantly improve the quality of life for those suffering from the disease, as they will offer more effective glucose control, reduced drug dosage, better patient compliance, and improved treatment control. The development of “closed- loop” systems require the creation of innovative non-invasive biosensors for the detection of glucose in biological fluids other than blood (e.g. in sweat) and nanocarriers for the automated administration of therapeutic treatment, by alternative routes, when needed. For this reason, the synthesis of more efficient and more biocompatible nanomaterials is necessary. Of all nanomaterials, graphene stood out early in biomedical applications, due to its excellent electrochemical properties. Its unique characteristics make it an ideal candidate for the development of high precision biosensors. In fact, graphene biosensors are state-of-the-art compared to conventional sensors in terms of resolution and sensitivity. The only reason why graphene has not completely taken over the world of medical applications, is the difficulty in producing high-quality graphene in large-scale, at a low cost and in an environmentally friendly way. In recent years, “green” chemistry techniques made possible the biological exfoliation of graphene from graphite without the use of toxic solvents. However, the biocompatibility of these structures with human cells and tissues has not been explored yet. The primary objective of this PhD thesis was to investigate whether the "green" exfoliation of graphite leads to the synthesis of more biocompatible nanomaterials compared to conventional methods. As the functional modification of nanomaterials affects both their characteristics and their toxicity, three different graphene- based structures were tested in vitro: graphene, nitrogen-doped (N-Doped) graphene and nitrate- bonded graphene. The three nanomaterials were synthesized by two different methods involving the use of chemical or biological solvents. It is known that the effects of nanomaterials differ in each cell type, so the toxicity of graphene nanomaterials was tested in three different cell lines (NIH/3T3 fibroblasts, HaCaT keratinocytes and THP-1 differentiated macrophages), which together constitute a skin model. Using modern methods, the immediate or long-term toxicity of nanomaterials to cells, the possible induction of cell death or oxidative stress, their effect on the cell cycle and their interaction with molecules that play an important role in critical signaling pathways of inflammation, were examined. Thorough cytotoxicity assessment proved that “green” synthesis of graphene maintains its uniqueness while limiting its negative effects on cells. Therefore, “green” graphene becomes an ideal candidate for biomedical applications, including the development of high- precision biosensors for non- invasive glucose detection. A second aim of this thesis was to investigate the effectiveness of innovative nanoemulsions to act as nanocarriers for transdermal release of commercial hypoglycemic drugs. In an in vivo model, it was shown that dapagliflozin, a common drug for DM, through nanoemulsions successfully penetrates the skin of laboratory animals and exerts its strong hypoglycemic effect without causing toxic reactions in the body. Combined, the development of innovative, non- toxic, non- invasive glucose sensors with “green” graphene and the use of nanoemulsions as nanocarriers for the transdermal delivery of antidiabetic drugs, may lead to the design of a fully automated “closed” system for the management of DM. This system will significantly improve the quality of life of the ever- increasing patients.

Ο Σακχαρώδης Διαβήτης (ΣΔ) είναι μια χρόνια μεταβολική διαταραχή που χαρακτηρίζεται από την απώλεια ελέγχου της ομοιόστασης της γλυκόζης από τον οργανισμό. Τις τελευταίες δεκαετίες η εξάπλωση του ΣΔ έχει λάβει επιδημικές διαστάσεις σε παγκόσμιο επίπεδο. Σύμφωνα με τη Διεθνή Ομοσπονδία Διαβήτη εκτιμάται ότι σήμερα 538 εκατομμύρια άνθρωποι παγκοσμίως πάσχουν από κάποια μορφή διαβήτη, ενώ ο αριθμός αυτός αναμένεται να φτάσει τα 783 εκατομμύρια έως το 2045. Ο ΣΔ αποτελεί πλέον ένα από τα μεγαλύτερα ζητήματα της δημόσιας υγείας επιδρώντας σημαντικά στην κοινωνικο- οικονομική ανάπτυξη κάθε χώρας. Η εξέλιξη της Νανοτεχνολογίας έδωσε ελπίδα στη διαχείριση του ΣΔ. Με την ανάπτυξη των συστημάτων συνεχούς καταγραφής της γλυκόζης και τις αντλίες ινσουλίνης μειώθηκαν σημαντικά τα επεισόδια υπο- και υπερ- γλυκαιμίας και βελτιώθηκε η ποιότητα των διαβητικών ασθενών. Ωστόσο, υπάρχουν περιθώρια βελτίωσης και πλέον γίνονται προσπάθειες για την ανάπτυξη νέων συστημάτων ανίχνευσης των επιπέδων γλυκόζης και χορήγησης της θεραπευτικής αγωγής. Πιο συγκεκριμένα, η έρευνα στοχεύει στην ανάπτυξη μη επεμβατικών «κλειστών» συστημάτων (closed-loop) για τη διαχείριση του ΣΔ τα οποία θα προσφέρουν όχι μόνο συνεχή καταγραφή της συγκέντρωσης της γλυκόζης αλλά και αποδέσμευση της ενδεδειγμένης θεραπευτικής ουσίας όποτε κρίνεται απαραίτητο. Τα συστήματα αυτά θα βελτιώσουν σημαντικά την ποιότητα ζωής των πασχόντων από την ασθένεια καθώς θα προσφέρουν πιο αποτελεσματικό έλεγχο της γλυκόζης, μειωμένη χορηγούμενη δόση φαρμάκου, καλύτερη συμμόρφωση του ασθενούς και καλύτερο έλεγχο της θεραπείας. Η δημιουργία των «κλειστών» συστημάτων απαιτεί την ανάπτυξη καινοτόμων μη επεμβατικών αισθητήρων ανίχνευσης της γλυκόζης σε υγρά εκτός του αίματος (π.χ. στον ιδρώτα) αλλά και νανοφορέων για την αυτοματοποιημένη χορήγηση της θεραπευτικής αγωγής, από εναλλακτικές οδούς, όποτε απαιτείται. Για τον λόγο αυτό, καθίσταται αναγκαία η σύνθεση πιο αποτελεσματικών και πιο βιοσυμβατών νανοϋλικών. Το γραφένιο είναι ένα νανοϋλικό το οποίο χάρη στις άριστες ηλεκτροχημικές του ιδιότητες ξεχώρισε νωρίς στις βιοϊατρικές εφαρμογές. Τα μοναδικά χαρακτηριστικά του το καθιστούν ιδανικό υποψήφιο για την ανάπτυξη βιοαισθητήρων υψηλής ακρίβειας. Μάλιστα, οι αισθητήρες γραφενίου αποτελούν τεχνολογία αιχμής σε σχέση με τους συμβατικούς αισθητήρες όσον αφορά την ανάλυση και την ευαισθησία. Ο λόγος για τον οποίο το γραφένιο δεν έχει πάρει ολοκληρωτικά τα ηνία σε ιατρικές εφαρμογές, είναι η δυσκολία παραγωγής σε μεγάλη κλίμακα και υψηλής ποιότητας γραφενίου με χαμηλό κόστος και περιβαλλοντολογικά φιλικό τρόπο. Τα τελευταία χρόνια, με τη χρήση των τεχνικών της «πράσινης» χημείας κατέστη δυνατή η αποφυλλοποίηση του γραφενίου από γραφίτη χωρίς τη χρήση τοξικών διαλυτών. Ωστόσο ακόμη δεν έχει διερευνηθεί η βιοσμβατότητα των δομών αυτών με ανθρώπινα κύτταρα και ιστούς. Πρωταρχικός στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν να διερευνήσει κατά πόσο η «πράσινη» αποφυλλοποίηση του γραφίτη οδηγεί στη σύνθεση πιο βιοσυμβατών νανοϋλικών σε σχέση με τις συμβατικές μεθόδους. Καθώς η λειτουργική τροποποίηση των νανοϋλικών επηρεάζει τόσο τα χαρακτηριστικά όσο και την τοξικότητά τους, ελέγχθηκαν in vitro τρεις διαφορετικές δομές που έχουν ως βάση το γραφένιο: γραφένιο, «ντοπαρισμένο» με άζωτο (N- Doped) γραφένιο και γραφένιο συνδεδεμένο με νιτρικά, οι οποίες συντέθηκαν με δύο διαφορετικές μεθόδους που περιλάμβαναν τη χρήση χημικών ή βιολογικών διαλυτών. Είναι γνωστό ότι οι επιδράσεις των νανοϋλικών διαφέρουν σε κάθε είδος κυττάρου και έτσι η τοξικότητα των νανοϋλικών γραφενίου ελέγχθηκε σε τρεις διαφορετικές κυτταρικές σειρές (ινοβλάστες NIH/3T3, κερατινοκύτταρα HaCaT και THP-1 διαφοροποιημένα μακροφάγα), οι οποίες μαζί αποτελούν ένα μοντέλο του δέρματος. Με σύγχρονες μεθόδους εξετάστηκε η άμεση ή μακροπρόθεσμη τοξικότητα των νανοϋλικών στα κύτταρα, η πιθανή πρόκληση κυτταρικού θανάτου ή οξειδωτικού στρες, η επίδρασή τους στον κυτταρικό κύκλο αλλά και η αλληλεπίδρασή τους με μόρια που παίζουν σημαντικό ρόλο σε κρίσιμα σηματοδοτικά μονοπάτια της φλεγμονής. Ο ενδελεχής έλεγχος κυτταροτοξικότητας απέδειξε ότι η «πράσινη» σύνθεση του γραφενίου διατηρεί τη μοναδικότητά του περιορίζοντας παράλληλα τις αρνητικές του επιδράσεις στα κύτταρα. Επομένως, το «πράσινο» γραφένιο καθίσταται ιδανικός υποψήφιος για βιοϊατρικές εφαρμογές, συμπεριλαμβανομένου της ανάπτυξης βιοαισθητήρων υψηλής ακρίβειας για την ανίχνευση της γλυκόζης μη επεμβατικά. Δεύτερος στόχος της διατριβής ήταν η διερεύνηση της αποτελεσματικότητας καινοτόμων νανογαλακτωμάτων να δράσουν ως νανοφορείς για τη διαδερμική απελευθέρωση εμπορικών υπογλυκαιμικών φαρμάκων. Σε in vivo μοντέλο αποδείχθηκε ότι η νταπαγλιφλοζίνη, ένα κοινό φάρμακο για τη διαχείριση του ΣΔ, μέσω των νανογαλακτωμάτων διαπερνά επιτυχώς το δέρμα των ζώων και ασκεί την ισχυρή υπογλυκαιμική της δράση χωρίς να προκαλεί τοξικές αντιδράσεις στον οργανισμό. Συνδυαστικά, η ανάπτυξη καινοτόμων, ασφαλών, μη επεμβατικών αισθητήρων γλυκόζης από «πράσινο» γραφένιο και η χρήση των νανογαλακτωμάτων ως νανοφορείς για τη διαδερμική απελευθέρωση των αντιδιαβητικών φαρμάκων, δύναται να οδηγήσουν στη δημιουργία ενός πλήρως αυτοματοποιημένου «κλειστού» συστήματος για τη διαχείριση του ΣΔ. Το σύστημα αυτό θα βελτιώσει σημαντικά την ποιότητα ζωής των πασχόντων από την ασθένεια, ο αριθμός των οποίων αυξάνεται με ραγδαίους ρυθμούς.