Phenotypic and functional characterization of circulating tumor cells (CTCs) from breast cancer patients with emphasis on triple negative (ER-/PR-/HER2-) breast cancer (TNBC)

Abstract

Triple-negative breast cancer (TNBC) stands out as the most aggressive breast cancer subtype, characterized by a lack of expression of estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2). Despite its aggressive nature, TNBC faces a significant dearth of targeted therapies, highlighting the pressing need for the identification of novel biomarkers. Notably, metastasis is responsible for approximately 90% of breast cancer-related deaths, with a pivotal role attributed to Circulating Tumor Cells (CTCs). Particularly, metastatic dissemination is associated with the presence of CTCs and Disseminated Tumor Cells (DTCs) in peripheral blood and bone marrow, respectively. However, metastasis is still not well understood and is largely incurable. Hence, there is an urgent need to explore the mechanisms that govern metastatic spread of cancer cells. Microtentacles (McTNs), are tubulin-based protrusions of the plasma membrane playing a pivotal role in the metastatic cascade. They are also associated with the Epithelial-to-Mesenchymal Transition (EMT) pathway. In this context, the detection and characterization of CTCs exhibiting an EMT phenotype is very important. These cells are of particular interest due to their potential association with high-risk prognosis and increased susceptibility to relapse and mortality. Traditionally, methods reliant on epithelial markers may inadvertently underestimate CTC numbers, necessitating a shift toward more comprehensive approaches. Moreover, BRCA1 mutations have been implicated in the predisposition to TNBC. The intricate interplay between BRCA1, PARP, and the DNA damage repair pathways further amplifies the significance of these factors in TNBC pathogenesis. Against this backdrop, our research aimed to contribute to the understanding of TNBC by examining the phenotype of CTCs in a cohort of 64 TNBC patients. An additional group of 30 hormonal-positive (luminal) patients were included in our analysis to provide a comparative context. Our investigation was focused on elucidating the expression profiles of key biomarkers, such as immune checkpoints (PD-L1, CTLA-4) and EMT-related molecules (GLU, VIM), in CTCs. These markers proved to be valuable indicators of disease severity and clinical outcomes. Furthermore, our study employed advanced technologies, including the FDA-approved Cell Search system to explore vimentin expression and the EMT phenotype in CTCs. This analysis, both in early and metastatic patients, revealed a novel (CK-VIM+CD45-) phenotype which enabled the detection of elusive cancer cells, offering insights into breast cancer prognosis and therapeutic strategies. Additionally, our research extended beyond mere characterization to functional analysis. Leveraging the innovative Tether Chips technology from the University of Maryland, our study explored the metastatic potential through McTN formation, and biomarker expression in viable CTCs isolated from TNBC patients post-treated with Vinorelbine (Vin), an FDA-approved drug. The rapid effects observed within just one hour on McTN formation, expression of key biomarkers, and apoptosis, suggest Vinorelbine as a potential strategy to inhibit metastatic spread in TNBC patients. Our findings also highlighted the importance of the functional analysis of CTCs, using TetherChips technology as a valuable tool for real-time investigation of drug efficacy on isolated, cultured CTCs. Furthermore, our investigation examined the effects of a new Combrestatin A4 (CA-4) analog on TNBC cell lines (MDA-MB-231 and MDA-MB-436), assessing viability, cytoskeletal organization (McTNs), migration capacity, and expression of important biomarkers (PD-L1, Α-TUBULIN, and VIM).The investigation of mutations in BRCA1 exon 20 and their correlation with PARP-1 expression in CTCs of TNBC patients added another layer of depth to our research. High nuclear expression of PARP-1 and the presence of BRCA1 mutations were identified as distinctive features of TNBC CTCs, offering biomarkers linked to patients' clinical outcomes and potentially the PARP-1 targeted therapies. In conclusion, our comprehensive research not only advances the understanding of TNBC but also opens promising avenues for assessing important biomarkers and new insights into personalized treatment approaches. The comprehensive knowledge gained from this study contributes to the evolving landscape of TNBC research, paving the way to target metastatic dissemination.

Ο τριπλά αρνητικός είναι ο πιο επιθετικός υπότυπος καρκίνος του μαστού (TNBC), ο οποίος χαρακτηρίζεται από έλλειψη έκφρασης του υποδοχέα οιστρογόνων (ER), του υποδοχέα προγεστερόνης (PR) και του υποδοχέα του ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα τύπου 2 (HER2). Εκτός του επιθετικού του χαρακτήρα και των αυξημένων ποσοστών μετάστασης, ο TNBC χαρακτηρίζεται από σημαντική έλλειψη στοχευμένων θεραπειών, γεγονός που αναδεικνύει την επιτακτική ανάγκη για τον προσδιορισμό νέων βιοδεικτών. Γενικότερα, η μετάσταση είναι υπεύθυνη για το 90% περίπου των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο του μαστού, με καθοριστικό ρόλο στην διαδικασία αυτή να έχουν τα Κυκλοφορούντα Καρκινικά Κύτταρα (CTCs) στο περιφερικό αίμα και τα Διεσπαρμένα Καρκινικά Κύτταρα (Disseminated Tumor Cells: DTCs) στον μυελό των οστών. Ωστόσο, ο μηχανισμός της μεταστατικής διασποράς δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητός, ενώ είναι γνωστό πως οδηγεί σε ανίατη νόσο. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να διερευνηθούν οι μηχανισμοί που οδηγούν στην εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων. Τα μικροπλοκάμια (McTNs), προεξοχές της πλασματικής μεμβράνης με βάση την τουμπουλίνη, έχουν αναδειχθεί ως κεντρικός μηχανισμός στη μετάσταση και σχετίζονται επίσης με την επιθηλιομεσεγχυματική μετατροπή (EMT). Στο πλαίσιο αυτό, η ανίχνευση και ο χαρακτηρισμός των CTCs που παρουσιάζουν EMT φαινότυπο καθίσταται υψίστης σημασίας. Τα κύτταρα αυτά παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον λόγω της συσχέτισής τους με πρόγνωση υψηλού κινδύνου και αυξημένη ευαισθησία στην υποτροπή και τη θνησιμότητα.Παραδοσιακά, οι μέθοδοι που βασίζονται σε επιθηλιακούς δείκτες ενδέχεται να υποεκτιμούν τον αριθμό των CTCs, γεγονός που καθιστά αναγκαία τη στροφή προς πιο ολοκληρωμένες προσεγγίσεις. Επιπλέον, οι μεταλλάξεις BRCA1 έχουν συνδεθεί με την προδιάθεση για TNBC. Η αλληλεπίδραση μεταξύ BRCA1, PARP και των μονοπατιών επιδιόρθωσης βλαβών του DNA ενισχύει περαιτέρω τη σημασία αυτών των παραγόντων στην εκδήλωση του TNBC υποτύπου. Σε αυτό το πλαίσιο, η παρούσα διατριβή επιδίωξε να συμβάλει στην κατανόηση του TNBC εξετάζοντας σχολαστικά τον φαινότυπο των CTCs σε μια ομάδα 64 ασθενών με TNBC. Για σύγκριση, στην ανάλυσή συμπεριλήφθηκαν επιπλέον 30 ορμονοθετικοί (luminal) ασθενείς. Η έρευνά επικεντρώθηκε στη διαλεύκανση της έκφρασης σημαντικών βιοδεικτών, όπως τα σημεία ανοσιακού ελέγχου (PD-L1, CTLA-4) και τα μόρια που σχετίζονται με το EMT (GLU, VIM), στα CTCs. Αυτά τα μόρια αποδείχθηκαν πολύτιμοι δείκτες της σοβαρότητας της νόσου και της κλινικής έκβασης των ασθενών. Επιπλέον, η έρευνα μας αξιοποίησε προηγμένες τεχνολογίες, συμπεριλαμβανομένου του εγκεκριμένου από τον FDA σύστημα CellSearch για τη διερεύνηση της έκφρασης της βιμεντίνης και του φαινοτύπου EMT στα CTCs. Η ανάλυση αυτή, τόσο σε ασθενείς σε πρώιμο στάδιο, όσο και σε μεταστατικούς ασθενείς, αποκάλυψε έναν νέο φαινότυπο (CK-VIM+CD45-) που επέτρεψε τον εντοπισμό μη ανιχνεύσιμων μέχρι τώρα, καρκινικών κυττάρων, προσφέροντας πληροφορίες για την πρόγνωση του καρκίνου του μαστού και τις θεραπευτικές στρατηγικές. Η έρευνά επιπλέον επεκτάθηκε πέρα από τον απλό χαρακτηρισμό και στη λειτουργική ανάλυση των CTCs. Αξιοποιώντας την καινοτόμο τεχνολογία των TetherChips, από το Πανεπιστήμιο του Maryland, στα πλαίσια της διακρατικής συνεργασίας με το εργαστήριο του καθηγητή Stuart Martin, μελετήθηκε η μεταστατική δυνατότητα των CTCs μέσω του σχηματισμού McTN και η έκφραση βιοδεικτών σε ζωντανά καρκινικά κύτταρα που απομονώθηκαν από το αίμα ασθενών με TNBC μετά από θεραπεία με Βινορελμπίνη (Vin), φάρμακο εγκεκριμένο από τον FDA. Η ταχεία επίδραση στον σχηματισμό των McTNs, στην έκφραση σημαντικών βιοδεικτών και στην επαγωγή απόπτωσης που παρατηρήθηκαν υποδηλώνουν ότι η Βινορελμπίνη είναι μία πιθανή στρατηγική για την αναστολή της μεταστατικής διασποράς σε ασθενείς με TNBC. Τα ευρήματά μας ανέδειξαν επίσης τη σημασία της λειτουργικής ανάλυσης των CTCs με τη χρήση της τεχνολογίας των TetherChips ως πολύτιμο εργαλείο για τη διερεύνηση της αποτελεσματικότητας των φαρμάκων σε πραγματικό χρόνο σε απομονωμένα και καλλιεργούμενα CTCs.Επιπλέον, η έρευνά ανέλυσε τις επιδράσεις ενός νέου ανάλογου Combrestatin A4 (CA-4) σε κυτταρικές σειρές TNBC (MDA-MB-231 και MDA-MB-436), διερευνώντας τη βιωσιμότητα, την κυτταροσκελετική οργάνωση των McTNs, την ικανότητα μετανάστευσης και την έκφραση σημαντικών βιοδεικτών όπως PD-L1, α-τουμπουλίνης και βιμεντίνης.Τέλος, πραγματοποιήθηκε ανίχνευση μεταλλάξεων στο εξόνιο 20 του BRCA1 και συσχέτισή τους με την έκφραση της PARP στα CTCs των ΤNBC ασθενών. Η μελέτη αυτή έδειξε ότι η υψηλή πυρηνική έκφραση της PARP-1 και ο εντοπισμός BRCA1 μεταλλάξεων είναι χαρακτηριστικά των CTCs ασθενών με TNBC, παρέχοντας χρήσιμους βιοδείκτες που σχετίζονται με τη κλινική έκβαση των ασθενών και την θεραπεία με PARP αναστολείς. Εν κατακλείδι, η πολύπλευρη έρευνά της παρούσας διατριβής όχι μόνο προάγει την κατανόηση του τριπλά αρνητικού καρκίνου μαστού, αλλά επίσης ανοίγει πολλά υποσχόμενα μονοπάτια για την αξιολόγηση σημαντικών βιοδεικτών και την πιθανή χρήση καινοτόμων εξατομικευμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Η ολοκληρωμένη γνώση που αποκτήθηκε από την παρούσα μελέτη συμβάλλει στο εξελισσόμενο τοπίο της έρευνας για τον TNBC, διαμορφώνοντας τον δρόμο για την στόχευση της μεταστατικής διασποράς.