Απομόνωση γηγενών οινοποιητικών μικροβιακών καλλιεργειών από ελληνικούς αμπελώνες και μελέτη των γονοτυπικών και τεχνολογικών χαρακτηριστικών τους

Abstract

The purpose of the PhD thesis was the isolation of indigenous microbial cultures and their study regarding their technological characteristics. The grape is a fruit of exemplary microbial diversity; it is considered the habitat of many microorganisms, including yeasts. Both their species and their population on the surface of the grapes are influenced by various factors, such as the grape variety, the climatic conditions during ripening, the soil, the farming techniques, the geographical location of the vineyard and the age of the vine. Microbiological cultures were isolated from grapes and musts subjected to spontaneous alcoholic fermentations on a micro-vinification scale. For our study, five Greek grape varieties (Malagousia, Assyrtiko, Vidiano, Moschofilero, Agiorgitiko), with particular oenological importance, were selected from five different wine-growing regions of Greece (Drama, Kavala, Thessaloniki, Halkidiki, Fthiotida) with conventional or organic farming.After the isolation and purification of the cultures, was performed phenotyping of 250 isolates by combining culture on Chromagar chromogenic medium and using the API ID32C identification system as well as study of phenotypic characteristics including differences in colony morphology, growth at extreme temperatures, phenotype and of tolerance to ethanol, to the presence of sulfuric anhydride, to high glucose concentrations and other stress factors. At the molecular level, PCR-Delta and PCR-ITS-RFLP techniques were applied due to their ability to distinguish S. cerevisiae yeasts from Non Saccharomyces as well as differentiation of Non Saccharomyces species using two restriction enzymes (HinfI and HaeIII) .In our study, we found that the grape of Malagousia and Assyrtiko varieties are a rich source of yeasts, as evidenced by the results obtained, as four different types of yeasts (Saccharomyces and Candida, Pichia, Kloeckera) were isolated. Overall, significant differences are maintained between the different grape varieties in terms of the qualitative and quantitative distribution of yeast species, since for the Assyrtiko variety cultivated in 3 different viticultural zones, Kluyveromyces thermotolerance yeast was isolated at the beginning and in the middle of fermentation in grapes from vineyards of conventional and organic farming. Based on the means and standard deviations of yeast species isolates in each region, a preference of each yeast species was mapped for each study region. However, only for S. cerevisiae was a statistically significant correlation with one of the regions observed. A small number of S. cerevisiae strains were found to be able to dominate alcoholic fermentation, regardless of grape variety and region. Similarly, stability was observed among dominant yeast karyotypes. As well as that at the end of the fermentations was mostly detected, in almost all cases, S. cerevisiae. The differentiation of phenotypic diversity does not seem to be related to the distance between plot locations, but perhaps to natural barriers (mountain ranges).After evaluating the oenological properties of 34 characteristic S. cerevisiae isolates, 8 strains were selected and were further tested as starters in alcoholic fermentations of Malagousia must, on a micro-vinification scale. Finally, the quality of the produced wines was evaluated by determining their chemical characteristics, their profile of aromatic compounds and their sensory evaluation. We concluded that 4 strains (one of which is superior) had the better vinification results, conclusion which also extends to the determination of aromatic compounds concentrations, characteristic aromatic compounds of the Malagousia variety, higher than the odor detection limit (as these have also been obtained from other studies) but also in the sensory evaluation.

Σκοπός της Διδακτορικής διατριβής ήταν η απομόνωση γηγενών μικροβιακών καλλιεργειών και η μελέτη τους όσον αφορά τα τεχνολογικά χαρακτηριστικά τους. Το σταφύλι είναι ένα φρούτο υποδειγματικής μικροβιακής ποικιλότητας, θεωρείται ο βιότοπος πολλών μικροοργανισμών, συμπεριλαμβανομένων των ζυμών. Τόσο το είδος τους όσο και ο πληθυσμός τους στην επιφάνεια των σταφυλιών επηρεάζονται από διάφορους παράγοντες, όπως η ποικιλία σταφυλιών, οι κλιματικές συνθήκες κατά την ωρίμανση, το έδαφος, οι καλλιεργητικές φροντίδες, η γεωγραφική θέση του αμπελώνα και η ηλικία της αμπέλου. Οι μικροβιολογικές καλλιέργειες απομονώθηκαν από σταφύλια και γλεύκη που υπέστησαν αυθόρμητες αλκοολικές ζυμώσεις σε κλίμακα μικροοινοποιήσεων. Για τη μελέτη μας επιλέχτηκαν πέντε Ελληνικές ποικιλίες αμπέλου (Μαλαγουζιά, Ασύρτικο, Βιδιανό, Μοσχοφίλερο, Αγιωργίτικο) με ιδιαίτερη οινολογική σημασία, από πέντε διαφορετικές αμπελουργικές περιοχές της Ελλάδας (Δράμα, Καβάλα, Θεσσαλονίκη, Χαλκιδική, Φθιώτιδα) συμβατικής ή βιολογικής καλλιέργειας. Μετά την απομόνωση και καθαρισμό των καλλιεργειών έγινε φαινοτυπικός προσδιορισμός 250 απομονώσεων με συνδυασμό της καλλιέργειας σε χρωμογόνο μέσο Chromagar και χρήσης του συστήματος ταυτοποίησης API ID32C όπως και μελέτη των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών συμπεριλαμβανομένων των διαφορών στη μορφολογία των αποικιών, της ανάπτυξης σε ακραίες θερμοκρασίες, του φαινότυπου και της ανοχής στην αιθανόλη, στην παρουσία θειώδη ανυδρίτη, σε υψηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης και άλλες καταπονήσεις. Σε μοριακό επίπεδο εφαρμόστηκαν οι τεχνικές PCR-Delta και PCR-ITS-RFLP λόγω της ικανότητάς τους να διακρίνουν της ζύμες S. cerevisiae από τις Non Saccharomyces όπως επίσης πραγματοποιήθηκε και διαφοροποίηση των ειδών Non Saccharomyces με τη χρήση δύο περιοριστικών ενζύμων (HinfI και HaeIII). Στην μελέτη μας διαπιστώνουμε ότι οι ρώγες σταφυλιού των ποικιλιών Μαλαγουζιά και Ασύρτικο αποτελούν μια πλούσια πηγή ζυμομυκήτων, όπως αποδεικνύεται από τα αποτελέσματα που προέκυψαν, καθώς απομονώθηκαν τέσσερα διαφορετικά είδη ζυμών (Saccharomyces και Candida, Pichia, Kloeckera). Συνολικά, διατηρούνται σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφορετικών ποικιλιών σταφυλιού όσον αφορά στην ποιοτική και ποσοτική κατανομή των ειδών ζύμης, αφού για την ποικιλία Ασύρτικο καλλιεργούμενη σε 3 διαφορετικές αμπελουργικές ζώνες απομονώθηκε ο ζυμομύκητας Kluyveromyces thermotolerance στην αρχή και στη μέση της ζύμωσης σε σταφύλια προερχόμενα τόσο από αμπελώνες συμβατικής όσο και βιολογικής καλλιέργειας. Βάση των μέσων όρων και των τυπικών αποκλίσεων των απομονώσεων ειδών ζυμομυκήτων σε κάθε περιοχή, αποτυπώθηκε μια προτίμηση του κάθε είδους ζυμομύκητα για κάθε περιοχή μελέτης. Ωστόσο, μόνο για τον S. cerevisiae παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συχέτιση με μία από τις περιοχές. Ένας μικρός αριθμός στελεχών S. cerevisiae βρέθηκε ότι μπορεί να κυριαρχήσει στην αλκοολική ζύμωση, ανεξάρτητα από την ποικιλία αμπέλου και την περιοχή. Παρομοίως, παρατηρήθηκε σταθερότητα μεταξύ των κυρίαρχων καρυοτύπων ζυμομύκητα. Όπως επίσης ότι στο τέλος των ζυμώσεων, σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις, ανιχνεύονταν κατά πλειοψηφία S. cerevisiae. Η διαφοροποίηση της φαινοτυπικής ποικιλότητας δεν φαίνεται να σχετίζεται με την απόσταση μεταξύ των τοποθεσιών των αμπελοτεμαχίων, παρά ίσως με φυσικά εμπόδια (οροσειρές). Μετά από αξιολόγηση των οινολογικών ιδιοτήτων 34 χαρακτηριστικών απομονώσεων S. cerevisiae ακολούθησε η επιλογή 8 στελεχών που δοκιμάστηκαν περαιτέρω ως εκκινητές σε αλκοολικές ζυμώσεις γλεύκους ποικιλίας Μαλαγουζιάς, σε κλίμακα μικροοινοποιήσεων, και τέλος αξιολογήθηκε η ποιότητα των παραγόμενων οίνων μέσω προσδιορισμού των χημικών χαρακτηριστικών, του προφίλ των αρωματικών ενώσεων και αισθητηριακής αξιολόγησης. Καταλήγουμε ότι τέσσερα στελέχη (με ένα εκ των οποίων να υπερτερεί) έχουν τα καλύτερα οινοποιητικά αποτελέσματα, τα οποία επεκτείνονται και στον προσδιορισμό συγκεντρώσεων, χαρακτηριστικών αρωματικών ενώσεων της ποικιλίας Μαλαγουζιά, υψηλότερων από το όριο ανίχνευσης οσμής (όπως αυτές έχουν προκύψει και από άλλες μελέτες) αλλά και στην αισθητήρια εκτίμηση.