O ρόλος των κυκλοφορούντων βιοδεικτών στην εκτίμηση της έκβασης ασθενών με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο πνεύμονα (NSCLC) που λαμβάνουν ανοσοθεραπεία

Abstract

Lung cancer is the leading cause of cancer related deaths worldwide in both sexes, with 1.8 million deaths recorded in 2020. Five-year survival ranges from 10-20% of all lung cancer cases, because most patients at the time of diagnosis already have advanced or metastatic disease, which limits the patient's treatment options and significantly reduces the probability of survival beyond five years. Targeted molecular therapies and recently immunotherapy have significantly improved the prognosis of lung cancer patients. Particularly, immunotherapy is an innovative therapeutic approach for metastatic lung cancer, which aims to activate the immune system and its components to suppress the tumor. However, despite the encouraging results from the administration of immunotherapy, clinical benefits are limited to a relatively small percentage of patients and therefore, the need to find new and more informative predictive biomarkers for use in daily clinical practice remains imperative. It is now known that tumors cause a disturbance in the peripheral immune response which is associated with the progression of the disease and with an unfavorable prognosis of the patients. Therefore, the analysis of biomolecules that have a key role in the regulation of the immune response and anticancer immunity, in peripheral blood as "liquid biopsy" samples from lung cancer patients, could reveal and highlight effective or easily accessible biomarkers. In this direction, the study of small non-coding RNA molecules (miRNAs) consists an important field of research as their expression has been found to be deregulated in a variety of pathological conditions, including NSCLC, while at the same time more and more data are converging that miRNAs can regulate the immune response against the tumor by modulating the gene expression of immunoregulatory molecules, at the post-transcriptional level, in the tumor and immune cells. Due to the involvement of miRNAs in the different stages of tumor initiation and progression, these molecules are being examined as potential prognostic and predictive biomarkers in cancer. The effectiveness of miRNAs as biomarkers lies in their high specificity and their expression pattern that differs between normal and pathological conditions. Their significant advantages are that due to their small size (19-24 nucleotides), they are extremely stable and can be easily determined in plasma samples with high reproducibility. Plasma constitutes a pool of miRNAs secreted from different sites of the primary tumor or metastatic foci, thus reflecting tumor heterogeneity. As a result, changes in the expression of miRNAs suggest a useful tool for early diagnosis and predicting the outcome of cancer patients. The present research aimed to analyze the expression and clinical evaluation of circulating miRNAs that regulate the immune response in the tumor microenvironment, in the plasma of patients with advanced or metastatic NSCLC. The miRNAs examined are those that regulate immune checkpoints (miR-34a, miR-200b, miR-200c), control the regulation of T regulatory cells Tregs (miR-155, miR-146) and myeloid derived suppressor cells (MDSCs) (miR-223), and finally, those that regulate macrophage differentiation towards M1 or M2 phenotype (let-7c, miR-26a, miR-30d, miR-195, miR-202). Two independent groups of patients were used to implement the objectives of this research. Group 1 included patients with advanced or metastatic NSCLC who were treated with first-line chemotherapy based on platinum compounds and Group 2 included patients with advanced or metastatic NSCLC who were treated with second-line immunotherapy with PD-1/PD-L1 inhibitors. Following that, quantification of the expression of the circulating miRNAs was performed in the samples of the patients of both groups, through real-time quantitative PCR. Investigation of the clinical significance of the studied miRNAs was performed through extensive statistical analysis. In the group of patients with advanced or metastatic NSCLC who were treated with first-line chemotherapy based on platinum compounds, the results of the analysis initially showed that miR-146a, miR-195, miR-200c and miR-223 exhibited differential expression between patients and the control group. In addition, the expression levels of miRNAs were related to various clinicopathological characteristics of the patients, such as age, performance status, histological subtype, the number of metastatic foci, the presence of brain and liver metastases, while they were also related to the objective response rate, with disease control rate and prolonged duration disease control. Low expression of miR-146a and high expression of miR-200c emerged as independent predictors of increased risk of developing disease progression as an optimal response to treatment in the whole population, while in the subgroup of patients with adenocarcinoma, low expression of miR-34a and high expression of miR-200c emerged as independent predictors for the same factor. High expression of miR-200c was associated with shorter overall survival in the whole population and high expression of miR-202 was associated with shorter progression free survival in the whole population, as well as with shorter overall survival in both the whole population and the subgroup of patients with adenocarcinoma. High expression of miR-26a was associated with shorter overall survival, while high expression of miR-155 was associated with shorter progression free survival and shorter overall survival, in the subgroup of patients with squamous cell carcinoma. Finally, high miR-202 expression emerged as an independent prognostic marker for shorter progression free survival in the whole population, while in the subgroup of patients with adenocarcinoma it was found to be an independent prognostic marker for shorter overall survival. Also, in the whole population, high expression of miR-200c emerged as an independent prognostic indicator for shorter overall survival. In the group of patients with advanced or metastatic NSCLC who had received second-line immunotherapy with PD-1/PD-L1 inhibitors, the results of the analysis initially showed that miR-26a, miR-30d, miR-34a, miR-146a, miR-155, miR-195, miR-200b, miR-200c, miR-202 and miR-223 exhibited differential expression between patients and the control group. In addition, the expression levels of miRNAs were related to various clinicopathological characteristics of the patients, such as performance status, the stage of the disease, the number of metastatic foci, the presence of liver and bone metastases, while at the same time they were also related to the disease control rate and the prolonged duration disease control. Low expression of miR-34a emerged as an independent predictor of increased risk of developing disease progression as an optimal response to treatment in the subgroup of patients with adenocarcinoma. Low miR-34a expression was associated with shorter progression free survival in the whole population, while in the subgroup of patients with adenocarcinoma it was associated with both shorter progression free survival and shorter overall survival. High expression of miR-200c was associated with shorter overall survival in both the whole population and in the subgroup of patients with adenocarcinoma, while in the subgroup of patients with adenocarcinoma, high expression of let-7c was associated with progression free survival. Low expression of miR-26a was associated with a shorter progression free survival in the subgroup of patients with squamous cell carcinoma. Finally, high miR-200c expression emerged as an independent predictor of shorter overall survival in both the whole population and the subgroup of patients with adenocarcinoma. In addition, low miR-34a expression was identified as an independent prognostic marker for shorter progression free survival and shorter overall survival in the subgroup of patients with adenocarcinoma. Also, low expression of miR-26a emerged as an independent predictor of shorter progression free survival in the subgroup of patients with squamous cell carcinoma. The last part of the present thesis aimed to identify the origin of circulating miRNAs. From the analysis of the results, the comparison of circulating miRNAs in matched samples of plasma and mononuclear cells showed that the expression of miRNAs from these two sources are independent and not related to each other, indicating that these miRNAs are possibly derived by the tumor cells. In conclusion, although the function of circulating miRNAs in the regulation of the immune response remains unclear, the interpretation of the role of these molecules as potential biomarkers is of great importance. The results of this research further support the hypothesis that the expression pattern of circulating miRNAs involved in the regulation of immune response and antitumor immunity through regulation of key elements of the immune system is related to patient survival and these molecules should be further studied as potential prognostic and predictive biomarkers in NSCLC.

Ο καρκίνος του πνεύμονα αποτελεί την πρώτη αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως και στα δύο φύλα, με 1.8 εκατομμύρια θανάτους εξαιτίας της νόσου να έχουν καταγραφεί για το 2020. Η πενταετής επιβίωση κυμαίνεται στο 10-20% του συνόλου των περιπτώσεων αυτών, καθ’ ότι η πλειονότητα των ασθενών τη στιγμή της διάγνωσης παρουσιάζουν ήδη προχωρημένη ή μεταστατική νόσο, περιορίζοντας τις θεραπευτικές επιλογές του ασθενή και μειώνοντας σημαντικά την πιθανότητα επιβίωσης πέραν των πέντε ετών. Οι στοχευμένες μοριακές θεραπείες και πρόσφατα η ανοσοθεραπεία έχουν βελτιώσει σε σημαντικό βαθμό την πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Ειδικότερα η ανοσοθεραπεία, αποτελεί μια καινοτόμο θεραπευτική προσέγγιση για τον μεταστατικό καρκίνο του πνεύμονα, που στοχεύει στην ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος και των στοιχείων του προκειμένου να καταστείλουν τον όγκο. Παρά όμως τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα από τη χορήγηση ανοσοθεραπείας, τα κλινικά οφέλη περιορίζονται σε ένα μικρό σχετικά ποσοστό ασθενών και επομένως, παραμένει επιτακτική η ανάγκη για την εύρεση νέων και περισσότερο πληροφοριακών προβλεπτικών βιοδεικτών για χρήση στην καθημερινή κλινική πρακτική.Είναι πλέον γνωστό ότι οι όγκοι προκαλούν διαταραχή στην περιφερική ανοσολογική απάντηση η οποία σχετίζεται με την εξέλιξη της νόσου και με δυσμενή πρόγνωση των ασθενών. Επομένως, η ανάλυση βιομοριών, που έχουν καίριο ρόλο στη ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης και της αντικαρκινικής ανοσίας, σε δείγματα περιφερικού αίματος ως υλικού “υγρής βιοψίας” από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα, θα μπορούσε να αποκαλύψει και να αναδείξει αποτελεσματικούς ή εύκολα προσβάσιμους βιοδείκτες. Προς αυτή την κατεύθυνση, η μελέτη των μικρών μη κωδικών μορίων RNA (miRNAs) αποτελεί σημαντικό πεδίο έρευνας καθώς η έκφραση τους έχει βρεθεί να είναι απορυθμισμένη σε πληθώρα παθολογικών καταστάσεων, συμπεριλαμβανομένου του ΜΜΚΠ, ενώ παράλληλα ολοένα και περισσότερα δεδομένα συγκλίνουν στο ότι τα miRNAs μπορούν να ρυθμίσουν την ανοσολογική απάντηση κατά του όγκου, επηρεάζοντας την γονιδιακή έκφραση ανοσορυθμιστικών μορίων, σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο, στον όγκο και τα ανοσοκύτταρα. Λόγω της συμμετοχής των miRNAs στα διάφορα στάδια έναρξης και εξέλιξης του όγκου, τα μόρια αυτά εξετάζονται ως πιθανοί προγνωστικοί και προβλεπτικοί βιοδείκτες στον καρκίνο. Η αποτελεσματικότητα των miRNAs ως βιοδείκτες έγκειται στην υψηλή ειδικότητα τους και στο μοτίβο έκφρασης τους το οποίο διαφέρει μεταξύ φυσιολογικής και παθολογικής κατάστασης. Σημαντικά πλεονεκτήματά τους είναι ότι εξαιτίας του μικρού τους μεγέθους (19-24 νουκλεοτίδια), είναι εξαιρετικά σταθερά και μπορούν εύκολα να προσδιοριστούν σε δείγματα πλάσματος με μεγάλη επαναληψιμότητα. Το πλάσμα αποτελεί μια δεξαμενή miRNAs που εκκρίνονται από διαφορετικά σημεία του αρχικού όγκου ή των μεταστατικών εστιών, αντανακλώντας την ετερογένεια του όγκου. Ως αποτέλεσμα, αλλαγές στην έκφραση των miRNAs προτείνουν ένα χρήσιμο εργαλείο για έγκαιρη διάγνωση και πρόβλεψη της έκβασης των ασθενών με καρκίνο. Δεδομένων των παραπάνω, στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η ανάλυση της έκφρασης και η κλινική αξιολόγηση κυκλοφορούντων miRNAs, που σχετίζονται με την ανοσολογική απόκριση στο μικροπεριβάλλον του όγκου, στο πλάσμα ασθενών με προχωρημένο ή μεταστατικό ΜΜΚΠ. Τα miRNAs που εξετάστηκαν στην παρούσα διατριβή δεν έχουν ακόμα μελετηθεί επαρκώς στον ΜΜΚΠ και αφορούν σε αυτά που ρυθμίζουν τα σημεία ελέγχου (miR-34a, miR-200b, miR-200c), που ελέγχουν τη ρύθμιση των Τ ρυθμιστικών κυττάρων Tregs (miR-155, miR-146) και των κατασταλτικών κυττάρων μυελοειδούς προέλευσης (MDSCs) (miR-223), και τέλος, σε αυτά που ρυθμίζουν την διαφοροποίηση των μακροφάγων προς Μ1 ή Μ2 φαινότυπο (let-7c, miR-26a, miR-30d, miR-195, miR-202). Για την υλοποίηση των στόχων της παρούσας έρευνας χρησιμοποιήθηκαν δύο ανεξάρτητες ομάδες ασθενών. Στην 1η ομάδα εντάχθηκαν ασθενείς με προχωρημένο ή μεταστατικό ΜΜΚΠ, οι οποίοι είχαν λάβει χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής με βάση πλατινούχα σύμπλοκα και στη 2η ομάδα εντάχθηκαν ασθενείς με προχωρημένο ή μεταστατικό ΜΜΚΠ, οι οποίοι είχαν λάβει ανοσοθεραπεία δεύτερης γραμμής με αναστολείς PD-1/PD-L1. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ποσοτικοποίηση της έκφρασης των παραπάνω κυκλοφορούντων miRNAs στα δείγματα των ασθενών και των δύο ομάδων, μέσω ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο. Η διερεύνηση της κλινικής σημασίας των μελετώμενων miRNAs πραγματοποιήθηκε μέσω εκτενούς στατιστικής ανάλυσης. Στην ομάδα των ασθενών με προχωρημένο ή μεταστατικό ΜΜΚΠ, οι οποίοι είχαν λάβει χημειοθεραπεία πρώτης γραμμής με βάση πλατινούχα σύμπλοκα, τα αποτελέσματα των αναλύσεων αρχικά έδειξαν ότι τα miR-146a, miR-195, miR-200c και miR-223 παρουσίασαν διαφορική έκφραση μεταξύ των ασθενών και της ομάδας ελέγχου. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs συσχετίστηκαν με διάφορα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών, όπως ήταν η ηλικία, η κλίμακα λειτουργικής κατάστασης, ο ιστολογικός υπότυπος, το πλήθος των μεταστατικών εστιών, η παρουσία εγκεφαλικών και ηπατικών μεταστάσεων, ενώ παράλληλα συσχετίστηκαν και με την αντικειμενική ανταπόκριση στη θεραπεία, με την ελεγχόμενη πορεία νόσου και την παρατεταμένη ελεγχόμενη νόσο. Ως ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες αυξημένου κινδύνου ανάπτυξης προόδου νόσου ως βέλτιστη απόκριση στη θεραπεία αναδείχθηκαν στο σύνολο του πληθυσμού η χαμηλή έκφραση του miR-146a και η υψηλή έκφραση του miR-200c και στο υποσύνολο των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα, η χαμηλή έκφραση του miR-34a και η υψηλή έκφραση του miR-200c. Η υψηλή έκφραση του miR-200c συσχετίστηκε με μικρότερη ολική επιβίωση στο σύνολο του πληθυσμού και η υψηλή έκφραση του miR-202 συσχετίστηκε με μικρότερο διάστημα ελεύθερο υποτροπής στο σύνολο του πληθυσμού, καθώς και με μικρότερη ολική επιβίωση και στο σύνολο του πληθυσμού και στο υποσύνολο των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα. Η υψηλή έκφραση του miR-26a συσχετίστηκε με μικρότερη ολική επιβίωση, ενώ η υψηλή έκφραση του miR-155 συσχετίστηκε με μικρότερο διάστημα ελεύθερο υποτροπής και με μικρότερη ολική επιβίωση, στο υποσύνολο των ασθενών με πλακώδες καρκίνωμα. Τέλος, η υψηλή έκφραση του miR-202 αναδείχθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης για μικρότερο διάστημα ελεύθερο υποτροπής στο σύνολο του πληθυσμού, ενώ στο υποσύνολο των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα βρέθηκε να αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη για μικρότερη ολική επιβίωση. Επίσης, στο σύνολο του πληθυσμού η υψηλή έκφραση του miR-200c αναδείχθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης για μικρότερη ολική επιβίωση. Στην ομάδα των ασθενών με προχωρημένο ή μεταστατικό ΜΜΚΠ, οι οποίοι είχαν λάβει ανοσοθεραπεία δεύτερης γραμμής με αναστολείς PD-1/PD-L1, τα αποτελέσματα των αναλύσεων αρχικά έδειξαν ότι τα miR-26a, miR-30d, miR-34a, miR-146a, miR-155, miR-195, miR-200b, miR-200c, miR-202 και miR-223 παρουσίασαν διαφορική έκφραση μεταξύ των ασθενών και της ομάδας ελέγχου. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs συσχετίστηκαν με διάφορα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των ασθενών, όπως ήταν η κλίμακα λειτουργικής κατάστασης, το στάδιο της νόσου, το πλήθος των μεταστατικών εστιών, η παρουσία ηπατικών και οστικών μεταστάσεων, ενώ παράλληλα συσχετίστηκαν και με την ελεγχόμενη πορεία νόσου και την παρατεταμένη ελεγχόμενη νόσο. Ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας αυξημένου κινδύνου ανάπτυξης προόδου νόσου ως βέλτιστη απόκριση στη θεραπεία αναδείχθηκε στο υποσύνολο των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα η χαμηλή έκφραση του miR-34a. Η χαμηλή έκφραση του miR-34a συσχετίστηκε με μικρότερο διάστημα ελεύθερο υποτροπής στο σύνολο του πληθυσμού, ενώ στο υποσύνολο των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα συσχετίστηκε και με μικρότερο διάστημα ελεύθερο υποτροπής και με μικρότερη ολική επιβίωση. Η υψηλή έκφραση του miR-200c συσχετίστηκε με μικρότερη ολική επιβίωση και στο σύνολο του πληθυσμού και στο υποσύνολο των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα, ενώ παράλληλα στο υποσύνολο των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα η υψηλή έκφραση του let-7c συσχετίστηκε με μικρότερο διάστημα ελεύθερο υποτροπής. Η χαμηλή έκφραση του miR-26a συσχετίστηκε με μικρότερο διάστημα ελεύθερο υποτροπής στο υποσύνολο των ασθενών με πλακώδες καρκίνωμα. Τέλος, η υψηλή έκφραση του miR-200c αναδείχθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης για μικρότερη ολική επιβίωση και στο σύνολο του πληθυσμού και στο υποσύνολο των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα. Επιπλέον, η χαμηλή έκφραση του miR-34a αναγνωρίστηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης για μικρότερο διάστημα ελεύθερο υποτροπής και μικρότερη ολική επιβίωση στο υποσύνολο των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα. Επίσης, η χαμηλή έκφραση του miR-26a αναδείχθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για μικρότερο διάστημα ελεύθερο υποτροπής στο υποσύνολο των ασθενών με πλακώδες καρκίνωμα. Το τελευταίο κομμάτι μελέτης της παρούσας διατριβής αφορούσε στην αποσαφήνιση της προέλευσης των κυκλοφορούντων miRNAs στο πλάσμα των ασθενών. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων, η σύγκριση των κυκλοφορούντων miRNAs σε αντιστοιχισμένα δείγματα πλάσματος και μονοπύρηνων κυττάρων έδειξε ότι η έκφραση των miRNAs από τις δύο αυτές πηγές είναι ανεξάρτητη και δεν σχετίζονται μεταξύ τους, υποδεικνύοντας ότι τα συγκεκριμένα miRNAs πιθανόν να προέρχονται από τα κύτταρα του όγκου. Συμπερασματικά, παρόλο που η λειτουργία των κυκλοφορούντων miRNAs στη ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης παραμένει ακόμα ασαφής, η μελέτη του ρόλου των μορίων αυτών ως πιθανοί βιοδείκτες είναι μεγάλης σημασίας. Τα αποτελέσματα της έρευνας αυτής υποστηρίζουν περαιτέρω την υπόθεση ότι το μοτίβο έκφρασης των κυκλοφορούντων miRNAs που εμπλέκονται στη ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης και της αντικαρκινικής ανοσίας μέσω ρύθμισης βασικών στοιχείων του ανοσολογικού συστήματος, σχετίζεται με την επιβίωση των ασθενών και τα μόρια αυτά αξίζει να μελετηθούν περαιτέρω ως πιθανοί προγνωστικοί και προβλεπτικοί βιοδείκτες στον ΜΜΚΠ.