Λειτουργική ανάλυση της ριβονουκλεοπρωτεΐνης hnRNPD ως προς τον καθορισμό των αποκρίσεων της έμφυτης ανοσίας και της φλεγμονής

Abstract

The cells of the innate immune system act against infection and tissue damage but also aid inflammatory resolution and tissue regeneration. This is exemplified in the case of macrophages, which adopt a diverse array of activated phenotypes with different functions (classical proinflammatory, alternative immunoregulatory or regenerative) in response to the ever-changing signals of the tissue micro-environment. Although current theories suggest that the phenotypic diversity of such cells can be driven by transcriptional or epigenetic networks, their extensive heterogeneity arising via plasticity is not congruent to their transcriptional determination. Alternatively, post-transcriptional mechanisms altering mRNA maturation or use via translation and decay in a signal-dependent manner could support the heterogeneity of innate immune cells.Post-transcriptional regulation relies on signalling interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and regulatory RNA structures of mRNA targets as well as regulatory noncoding RNAs. The outcome of such interactions is the formation of dynamic ribonucleoprotein complexes (RNPs) which control the fate of mRNA subsets driving specific cellular reactions (RNA regulons). A characteristic example of such proteins entails the collection of AREBPs so called for their affinities RNA motifs, rich in Adenine and Uracil (Au-rich elements- AREs) in the 3’ untranslated termini of physiologically relevant mRNAs. Data stemming from the in vivo analyses of mouse mutants for three members of this family -Elavl1, TISS11, TIA1- indicate their involvement in the control of pro-inflammatory activation and against tissue damage. However, the functions of the prototype members- i.e., the four isoforms of HNRNPD/AUF1- in inflammation appear nebulous due to the senescent phenotypes of the corresponding whole-body knock-outs. The main objective of the research presented herein was to clarify the functional roles of HNRNPD/AUF1 in innate immune ontogeny and inflammatory reactivity. To address this objective, we developed a new mouse system for the conditional ablation of two critical exons (3&4) of the hnRNPD locus which was then used for the myeloid-specific ablation of all HNRNPD/AUF1 isoforms-particularly in monocyte/macrophages and neutrophils. Contrary to whole-body mutants, the myeloid mutants of HNRNPD/AUF1 developed normally and displayed a normotypic response to acute inflammatory assaults as in the case endotoxemia. Moreover, they displayed an equal normotypic response to chemically-induced intestinal inflammation where innate immune cells drive pathologic cell-mediated Type I T-cell reactions. In sharp contrast, the myeloid mutants HNRNPD/AUF1 displayed resistance in the development of allergic airway inflammation in the lung associated with the reduced infiltration of cells relating to Type II T-cell responses.The ex-vivo analysis of macrophages revealed the HNRNPD/AUF1 proteins were dispensable for synthesis of inflammatory mediators induced by classical proinflammatory signals. Notably, they were also dispensable for the induction of prototypical alternative phenotypes such as those elicited by IL4, IL10 & TGFb. In contrast the HNRNPD/AUF1 proteins were essential for the switch of pro-inflammatory macrophages towards a tissue regenerative/pro-angiogenic phenotype when exposed to extracellular ATP by-products, like adenosines. Mechanistically, we showed that adenosine receptor signals enforce the binding of the HNRNPD/AUF1 proteins to mRNAs that support both pro-inflammatory and pro-angiogenic activation with a differential outcome in their use in favour of the pro-angiogenic phenotype. Congruent to this, the myeloid mutants of the HNRNPD/AUF1 proteins displayed lower levels of angiogenic factors in bronchioalveolar fluid of allergen afflicted lungs. Moreover, they failed to support the growth of transplanted melanoma tumours, as well as the vascularization and inflammatory infiltration of grafts unless supplemented with exogenous angiogenic factors. Finally, and in an effort to assess the possibility of the HNRNPD/AUF1 interactions to the ELAVL1/HuR that has been numerously suggested in the literature we generated myeloid mutants lacking both types of RBPs. The analyses of these double mutants suggested that HNRNPD/AUF1 competes with ELAVL1/HuR for the regulation of pro-inflammatory responses; but synergizes with it for the elicitation of allergic responses.Taken together, our data demonstrate that the HNRNPD/AUF1 proteins are important for the regenerative and pro-angiogenic functions of innate immune cells. Furthermore they suggest that the heterogeneity of innate immune cells may arise due to the post-transcriptional functions of ribonucleoprotein complexes.

Τα κύτταρα της έμφυτης ανοσίας αποκρίνονται έναντι της λοίμωξης και του εκφυλισμού των ιστών, ενώ συγχρόνως δρουν και προς την αναδόμηση των ιστών. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελούν τα μακροφάγα κύτταρα τα οποία υιοθετούν ποικίλους ενεργοποιημένους φαινοτύπους με διαφορετικές δράσεις (κλασικούς προφλεγμονώδεις, εναλλακτικούς ανοσορυθμιστικούς ή αναδομικούς) προσαρμοζόμενα σε αναδιαμορφωμένα ιστικά μικροπεριβάλλοντα. Παρόλο που τρέχουσες θεωρίες υποστηρίζουν ότι ο φαινοτυπικός καθορισμός τέτοιων κυττάρων μπορεί να καθοδηγείται από μεταγραφικά ή επιγενετικά δίκτυα διαφοροποίησης, το εύρος της φαινοτυπικής ετερογένειας που επιδεικνύουν δεν συνάδει με τον αποκλειστικό μεταγραφικό καθορισμό τους. Επιπρόσθετες παράμετροι φαινοτυπικού καθορισμού θα μπορούσαν να αποτελούν οι μεταμεταγραφικοί μηχανισμοί επιλεκτικής ωρίμανσης και χρήσης των mRNA μέσω πρωτεϊνοσύνθεσης ή αποικοδόμησης.Η επιλεκτική μεταμεταγραφική ρύθμιση βασίζεται στις σηματοδοτούμενες αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών που προσδένουν RNA (RBPs) σε ειδικές θέσεις των mRNA στόχων τους και σε ρυθμιστικά μη κωδικά RNA. Ως αποτέλεσμα αυτών των αλληλεπιδράσεων δημιουργούνται ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύμπλοκα (RNPs) που επηρεάζουν υποσύνολα mRNA τα οποία σχετίζονται με συγκεκριμένες κυτταρικές αντιδράσεις (RNA ρεγκουλόνια). Χαρακτηριστικό είναι το παράδειγμα των πρωτεϊνών AREBP που προσδένουν RNA δομές πλούσιες σε βάσεις ουρακίλης ή και αδενίνης (AU-rich elements; AREs) στα 3’ μη μεταφραζόμενα άκρα των mRNA. Τα έως τώρα δεδομένα που προέρχονται από την ανάλυση μεταλλαγμάτων τριών εξ’αυτών-Elavl1, TISS11/Zfp36 & TIA1, υποδεικνύουν την κυρίαρχη δράση τους στην καταστολή των προφλεγμονωδών αντιδράσεων των κυττάρων της έμφυτης ανοσίας προς αποφυγήν ιστικής βλάβης. Τα στοιχεία που αφορούν όμως τα πρότυπα μέλη αυτής της οικογενείας-τις τέσσερις ισομορφές HNRPD/AUF1- στην έμφυτη ανοσία παραμένουν νεφελώδη λόγω του ισχυρού φαινοτύπου γήρανσης κι εκφυλισμού των καθολικών μεταλλαγμάτων τους σε μύες. Αντικείμενο έρευνας της παρούσης διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η ανάλυση του λειτουργικού ρόλου των HNRNPD/AUF1 στην ομοιόσταση της έμφυτης ανοσίας και των αποκρίσεων αυτής στο πλαίσιο μοντελοποιημένων φλεγμονοδών αποκρίσεων κλινικής σημασίας. Για το σκοπό αυτό, δημιουργήθηκε ένα νέο σύστημα επιλεκτικής αφαίρεσης δύο κομβικών εξονίων (3&4) από το γονιδωματικό τόπο hnRNPD των μυών το οποίο ακολούθως χρησιμοποιήθηκε για τη μυελική απενεργοποίηση όλων των ισομορφών των HNRNPD/AUF1 in vivo, και -κατ’επέκτασην- σε μονοκύτταρα/μακροφάγα και ουδετερόφιλα. Σε αντίθεση με τους μύες που έφεραν καθολικές μεταλλάξεις αποσιώπησης, μύες που έφεραν μυελικές μεταλλάξεις του γονιδίου hnRNPD, δεν εμφάνισαν αποκλίσεις στην οξεία προφλεγμονώδη πρόκληση μετά από τη χορήγηση βακτηριακών λιποπολυσακχαριτών (ενδοτοξιναιμία). Αντίστοιχα, δεν παρουσίασαν διαφορές ως προς την ανάπτυξη χημικά επαγόμενων εντερικών φλεγμονών όπου τα κύτταρα της έμφυτης ανοσίας προωθούν τις παθολογικές κυτταρικές αποκρίσεις τύπου Ι των T-λεμφοκυττάρων της επίκτητης ανοσίας. Αντίθετα, μύες που έφεραν μυελικές μεταλλάξεις του γονιδίου hnRNPD επέδειξαν ιδιαίτερη ανθεκτικότητα στην ανάπτυξη αλλεργικής φλεγμονής των αεραγωγών του πνεύμονα και μειωμένη διήθηση ανοσοκυττάρων που σχετίζονται με τις κυτταρικές αποκρίσεις τύπου ΙΙ. Εx-vivo αναλύσεις των μακροφάγων αποκάλυψαν ότι η απώλεια των πρωτεϊνών HNRNPD/AUF1 δεν επηρέασε την επαγωγή της έκφρασης των κυτοκινών από σηματοδότες κλασσικής προφλεγμονώδους ενεργοποίησης/πόλωσης αλλά ούτε και από σηματοδότες ενναλακτικής πόλωσης (όπως των IL-4, TGF-β και IL-10), οι οποίοι συμμετέχουν σε αλλεργικές αντιδράσεις. Ωστόσο, οι πρωτεΐνες HNRNPD/AUF1 ήταν απαραίτητες για τη μετάβαση των προφλεγμονωδών μακροφάγων προς έναν αναδομικό/προαγγειογενετικό φαινότυπο ο οποίος επάγεται από προϊόντα εξωκυτταρικού ATP, και συγκεκριμένα αδενοσίνες. Σε επίπεδο μοριακού μηχανισμού, αποδείξαμε ότι η σηματοδότηση μέσω των υποδοχέων των αδενοσινών, ενισχύει την αλληλεπίδραση των HNRNPD/AUF1 με RNA μετάγραφα που υποστηρίζουν προφλεγμονώδη και αναδομικά μετάγραφα και ακολούθως ρυθμίζουν διαφορικά την έκφραση τους για τη μετάβαση από τον προφλεγμονώδη προς τον αναδομικό/προαγγειογενετικό φαινότυπο. Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα, οι μύες που έφεραν μυελικές μεταλλάξεις του γονιδίου hnRNPD επέδειξαν μειωμένα επίπεδα παραγόντων αγγειακής αναδόμησης στο βρογχοκυψελιδικό υγρό των πνευμόνων που εκτέθηκαν σε αλλεργιογόνα. Επιπρόσθετα, δεν κατάφεραν να υποστηρίξουν την ανάπτυξη μεταμοσχευμένων όγκων μελανώματος καθώς και την αγγείωση και τη διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων σε μοσχεύματα χωρίς την εξωγενή χορήγηση αγγειογενετικών παραγόντων. Παράλληλα διερευνήθηκε η γενετική αλληλεπίδραση μεταξύ των HNRNPD/AUF1 και ELAVL1/HuR στις αντιδράσεις της έμφυτης ανοσίας λόγω πολλαπλών αναφορών για ενδεχόμενη μοριακή αλληλεπίδραση. Η δημιουργία μυών που φέρουν συνδυαστικές μεταλλάξεις αποσιώπησης στα κύτταρα της μυελικής σειράς υπέδειξε ότι οι HNRNPD/AUF1 και ELAVL1/HuR έχουν ανταγωνιστικές δράσεις ως προς τον καθορισμό των προ-φλεγμονωδών αποκρίσεων, αλλά συνεργικές ως προς τις αλλεργικές ανοσοαποκρίσεις.Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα μας αναδεικνύουν τις HNRNPD/AUF1 ως καθοριστικές για την προώθηση των αναδομικών δράσεων της έμφυτης ανοσίας και υποδεικνύουν ότι η ετερογένεια των κυττάρων της έμφυτης ανοσίας ενδέχεται να οφείλεται στις μεταμεταγραφικές δράσεις ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων.