Όψεις του ενδιάμεσου μεταβολισμού καρκινικών κυτταρικών σειρών και δράσεις ειδικών αναστολέων επί ενζύμων σχετιζομένων με την παραγωγή ΑΤΡ

Abstract

The toxicity of chemotherapeutic agents serves as a limiting factor in cancer treatment. Many efforts have been done to overcome this major problem. The identification of the biochemical differences between normal and cancer cells is necessary to design new anticancer drugs. Warburg’s hypothesis consists possibly an effective therapeutic approach for cancer treatment. More researches, especially after 2000, focus on the therapeutic effect of glycolytic inhibitors, presenting encouraging results for further research. The major problem of the existing drugs - inhibitors of the glycolytic pathway is their instability. Coupling these molecules with metals compounds would probably ameliorate their half life time.In this study, we investigated the biological effect of ten novel metal compounds, six vanadium and four zinc compounds. Cell growth inhibition of several cancer and normal cell lines, as leiomyosarcoma from Wistar rat (LMS), human breast cancer adenocarcinoma (MCF-7), human cervical cancer (HeLa), human hepatocellular adenocarcinoma and normal human fibroblasts (MRC-5), using all the above complexes, was evaluated using the MTT assay. Flow cytometry analysis (FACS) was used to determine the cell type death after treatment with the complexes. Further, high density clonogenic assay was used to determine the ability of those compounds to inhibit the colony formation of cancer cells and bacterial growth. The effect of all complexes to the metabolic capacity of cells through the measurement of oxidation-reduction reactions, which principally occur in the mitochondria of live cells, was also analyzed. To investigate the glycolytic rate of cancer cells and their activity to the glycolytic pathway, we measured the glucose consumption, the production of both ATP and lactate, and the expression of GAPDH, in the presence or absence of the complexes. Finally, we tested the acute toxicity of the complex 7 on healthy Wistar rats, for the determination of LD50 value, as a marker for toxicity.In vitro experiments revealed that all metal complexes exert dose-dependent cytotoxic activity against all cancer cell lines. Complexes present less effect on the normal cell line. The cell death is mainly driven by apoptotic phenomena, which is consistent with the results from clonogenic assay.C. glutamicum showed a slightly reduced growth in presence of C1 and C2. As for complex 9 and its ligand, their presence in the growth medium caused a strong inhibition in Z. mobilis growth.Among all cell lines, ΗepG2 cells consume the highest amounts of glucose. After incubating cells with increasing concentrations of the complexes, a decrease in the glucose consumption was observed. LMS cells presented showed the highest sensitivity in the presence of the complexes, while complex 7 had the most potent action. HepG2 cells produce more ATP compared to the other cell lines, in the absence of the complexes. After the addition of the complexes, the production of ATP decreased in a dose dependent manner.LMS cells produce the higher amount of lactate, in amounts far in excess to the other cell lines. After the incubation with the complexes, lactate production was decreased in a dose dependent manner. The results from the study of redox reactions into mitochondria showed that the complexes cause damage to the respiratory function, yet smaller than inhibiting the production of lactate. HepG2 cells present overexpression of GAPDH, compared to MRC-5 cells. A slight reduction to the expression of GAPDH is observed at HeLa cells. Under-expression is observed at LMS cells, while MCF-7 cells express GAPDH, as the MRC-5 cells. After the incubation with the complexes 1,2 and 7 a strong under-expression of GAPDH was observed. Complex 7 caused the stronger under-expression of GAPDH, and in fact, at LMS cells GAPDH is slightly expressed. Finally, the in vivo experiments revealed that complex 7, tested on healthy Wistar rats for its toxicity, after a single dose of administration, of 100 mg / kg body weight, exerts toxic effects,while lower doses did not result in significant damage.Based on the selective cytotoxicity of this complex to cancer cell lines towards neoplastic cells, the inhibition that cause to the glycolytic pathway, and its lower toxicity in Wistar rats, we suggest a further pharmacokinetic study and research of its possible anticancer action.

Η εκλεκτική τοξικότητα των χημειοθεραπευτικών μέσων, ώστε να μην βλάπτονται τα υγιή κύτταρα είναι το μεγαλύτερο πρόβλημα που πρέπει να αντιμετωπιστεί για την θεραπεία της νεοπλασματικής νόσου. Η παρατήρηση του Warburg ίσως αποτελεί μια πολύ καλή θεραπευτική προσέγγιση για την αντιμετώπιση των νεοπλασιών. Πολλές μελέτες, κυρίως μετά το 2000, εστιάζουν στις θεραπευτικές ιδιότητες των αναστολέων της γλυκολυτικής οδού. Ένα πρόβλημα των ήδη υπαρχόντων αναστολέων της γλυκολυτικής οδού είναι πως δεν είναι σταθερές. Μια ενδεχόμενη σύνδεση των ουσιών αυτών με μέταλλα, υπό τη μορφή σύμπλοκων ενώσεων πιθανόν θα έλυνε το πρόβλημα αυτό. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η δράση δέκα νεοσυντεθιμένων συμπλόκων μετάλλων, έξι συμπλόκων του βαναδίου και τεσσάρων του ψευδαργύρου. Σε πρώτο επίπεδο, μελετήθηκε η αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των λειομυοσαρκωματικών κυττάρων επίμυος Wistar (LMS), των κυττάρων αδενοκαρκινώματος μαστού ανθρώπου (MCF-7) και αδενοκαρκινώματος τραχήλου μήτρας ανθρώπου (ΗeLa), των κυττάρων ηπατοκυτταρικού καρκίνου ανθρώπου (HepG2) και των φυσιολογικών ινοβλαστών μετά από επώαση με τα σύμπλοκα των 1-10. Ελέγχτηκε εν συνεχεία η ικανότητα τους να αναστέλλουν την ικανότητα των κυττάρων LMS να αναπτύσσουν μεγάλες, αυτοσυντηρούμενες αποικίες, καθώς και ο μηχανισμός με τον οποίο επάγουν τον κυτταρικό θάνατο. Τα σύμπλοκα μελετήθηκαν επιπλέον ως προς την πιθανή αντιβακτηριακή τους δράση, αλλά και ως προς την επίδρασή τους στις οξειδο-αναγωγικές αντιδράσεις των μιτοχονδρίων όλων των κυτταρικών σειρών. Για την διερεύνηση του γλυκολυτικού ρυθμού των νεοπλασματικών κυττάρων, καθώς και της δράσης των συμπλόκων στην γλυκολυτική πορεία, εξετάστηκε η κατανάλωση γλυκόζης, η παραγωγή ATP και γαλακτικού οξέος, καθώς και η έκφραση του ενζύμου της αφυδρογονάσης της 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (GAPDH), παρουσία και απουσία των συμπλόκων.Τέλος, μελετήθηκε η οξεία τοξικότητα του συμπλόκου 7 σε επίμυες Wistar, για τον προσδιορισμό της LD50 τιμής του και της τοξικής του επίδρασης σε επίπεδο οργανισμού. Τα in vitro πειράματα απέδειξαν πως και τα δέκα σύμπλοκα μετάλλων ασκούν δοσοεξαρτώμενη κυτταροτοξική δράση έναντι των κυττάρων LMS, MCF-7, ΗeLa και HepG2. Τα σύμπλοκα παρουσίασαν ηπιότερη δράση στη κυτταρική σειρά των φυσιολογικών ινοβλαστών. Ο μηχανισμός πρόκλησης κυτταρικού θανάτου είναι ο αποπτωτικός, ενώ η επώαση με τα σύμπλοκα προκάλεσε αναστολή της ικανότητας ανάπτυξης μεγάλων αποικιών. Το στέλεχος C. glutamicum παρουσίασε μικρή μείωση στην ανάπτυξή του παρουσία των συμπλόκων ψευδαργύρου 7 και 8. Όσον αφορά το σύμπλοκο 9 και τον υποκαταστάτη του, η παρουσία τους στο καλλιεργητικό μέσο προκάλεσε ισχυρή αναστολή της ανάπτυξης του βακτηρίου Z. Mobilis.Τα κύτταρα ΗepG2 καταναλώνουν την μεγαλύτερη ποσότητα γλυκόζης. Μετά από επώαση των κυττάρων με αυξανόμενες συγκεντρώσεις των συμπλόκων παρατηρήθηκε μείωση της κατανάλωσης γλυκόζης, η οποία έφτασε και σε μηδενικά επίπεδα. Τα κύτταρα LMS παρουσίασαν την μεγαλύτερη ευαισθησία παρουσία των συμπλόκων, ενώ το σύμπλοκο 7 του ψευδαργύρου είχε την πιο ισχυρή δράση. Τα κύτταρα HepG2 παράγουν το περισσότερο ATP σε σχέση με τις υπόλοιπες κυτταρικές σειρές, απουσία των συμπλόκων. Μετά την προσθήκη των συμπλόκων η παραγωγή ATP μειώθηκε με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Τα κύτταρα LMS παράγουν το περισσότερο γαλακτικό οξύ, σε ποσότητες κατά πολύ μεγαλύτερες σε σχέση με τις υπόλοιπες κυτταρικές σειρές. Μετά την προσθήκη των συμπλόκων η παραγωγή γαλακτικού οξέος μειώθηκε με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Τα αποτελέσματα από την μελέτη των πραγματοποιούμενων οξειδοαναγωγικών αντιδράσεων των μιτοχονδρίων έδειξαν πως τα σύμπλοκα προκαλούν βλάβες στην αναπνευστική λειτουργία, μικρότερης κλίμακας όμως από την αναστολή στην παραγωγή γαλακτικού οξέος. Η κυτταρική σειρά HepG2 παρουσιάζει υπερέκφραση του ενζύμου της GAPDH, σε σύγκριση με τα κύτταρα των φυσιολογικών ινοβλαστών. Μικρή μείωση της έκφρασης παρατηρείται στην κυτταρική σειρά HeLa. Υποέκφραση παρατηρείται στην κυτταρική σειρά LMS, ενώ τα κύτταρα MCF-7 εκφράζουν την GAPDH, όπως οι φυσιολογικοί ινοβλάστες. Μετά την προσθήκη των συμπλόκων 1,2 και 7 παρατηρήθηκε έντονη υποέκφραση του ενζύμου. Τέλος, τα in vivo πειράματα έδειξαν ότι το σύμπλοκο 7 που δοκιμάστηκε στους επίμυες Wistar εμφανίζει τοξική δράση μετά από την εφάπαξ χορήγηση του, σε ποσότητα 100 mg/kg βάρους σώματος, ενώ σε μικρότερες δόσεις δεν επιφέρει σημαντικές βλάβες.Με βάση την εκλεκτική ως προς τα νεοπλασματικά κύτταρα κυτταροτοξική δράση του συμπλόκου αυτού, την αναστολή που προκαλεί στην γλυκολυτική πορεία, και την μειωμένη τοξικότητα του στους επίμυες, προτείνεται η περαιτέρω φαρμακοκινητική μελέτη και ο έλεγχος της πιθανής αντικαρκινικής του δράσης.