Ανοσογενετική ανάλυση μεγάλης κλίμακας και μοριακός χαρακτηρισμός των Τ λεμφοκυττάρων σε διαφορετικής πρόγνωσης ασθενείς με Χρόνια Λεμφοκυτταρική Λευχαιμία

Abstract

Microenvironmental interactions of the malignant clone with bystander T cells are critical throughout the natural history of chronic lymphocytic leukemia (CLL). T cells in CLL serve as a source of trophic signals for the survival of the malignant clone. Alterations in the T cell transcriptome combined with functional exhaustion undermine cytotoxic responses against tumor cells, promoting tumor evasion and escape from immunosurveillance. T cells in CLL also display anti-tumor properties that can be unleashed under stimulation, leading to tumor control. Thus, the recruitment of activated T cells in immune responses against CLL cells represents a promising alternative form of immunotherapy. However, despite early encouraging results of immunotherapy in CLL, only a few patients will benefit and even fewer will experience durable remissions, highlighting the need for a thorough study of T cells in CLL microenvironment.The present study interrogated the T cell receptor (TR) gene repertoire, the composition of cell subpopulations and the functional dynamics of T cells in patients with CLL. In detail, immunogenetic analysis of the TR repertoire was performed in patient subgroups defined by: i) the characteristics of the clonotypic immunoglobulin of the B lymphocyte receptor (BCR IG), namely the SHM status and BcR IG stereotypy, and ii) recurrent genomic aberrations in the genome of CLL cells. Immunogenetic analysis revealed TR repertoire restriction and oligoclonal T cell expansions that persisted and expanded over time. In addition, common clonotypes were identified, shared amongst patients belonging in the same prognostic group or exclusively between CLL patients, supporting that antigen selection processes actively shape the TR repertoire in CLL. These antigens may derive from a limited range of CLL-specific antigens and/or neo-antigens on the leukemic cells. These findings were supported by the in silico prediction of T cells with specificity against neoepitopes postulated to arise from genomic lesions in the TP53 and NOTCH1 genes in the respective subgroups. Τo investigate the impact of different therapies on TR repertoire dynamics, comparative longitudinal analysis of the TR repertoire was performed at the initiation and under different treatment modalities, namely chemoimmunotherapy, or novel agents (inhibitors of BcR signaling or apoptosis). These experiments were combined with analysis of T cell subpopulations by flow cytometry. We found that treatment with novel agents led to a dynamic shift of T cell subpopulations towards activated effector-memory T cells, and we identified TR clonotypes that were retained and further expanded under treatment proportionally to the depth of the clinical response. Finally, confocal microscopy and transcriptome sequencing highlighted functional restoration of T cells after treatment, as they reversed key lesions described as a hallmark of dysfunctional T cells in CLL. In particular, treatment with BcR signaling inhibitors led to the formation of functional immune synapse between T and CLL cells, while the inhibition of the anti-apoptotic protein BCL-2 led to significant changes in the expression profile of CD8+ cells, stemming from downregulation of molecules involved in inhibitory signaling pathways. In conclusion, the present thesis offers strong evidence for the existence of specific anti-leukemic T lymphocytes in CLL targeting neo-antigens on the leukemic clone. These specific T cells display functional restoration under different therapies, further supporting current efforts for T-cell based immunotherapy towards reinvigorating immune responses against CLL cells.

Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κακοήθων Β και των Τ λεμφοκυττάρων στο μικροπεριβάλλον της Χρόνιας Λεμφοκυτταρικής Λευχαιμίας (ΧΛΛ) είναι καθοριστικές για τη παθοφυσιολογία της νόσου. Τα Τ λεμφοκύτταρα στη ΧΛΛ εμφανίζουν διττό ρόλο, καθώς παρέχουν τροφικά σήματα υποστηρίζοντας την επιβίωση των λευχαιμικών κυττάρων, ενώ διατηρούν πληθυσμούς με αντι-λευχαιμικές ειδικότητες που, υπό συνθήκες, ενεργοποιούνται και στρέφονται έναντι των ΧΛΛ κυττάρων. Η στρατολόγηση ενεργοποιημένων Τ κυττάρων σε ειδικές ανοσοαποκρίσεις που στοχεύουν τα ΧΛΛ κύτταρα αποτελεί μια εναλλακτική μορφή ανοσοθεραπείας για την αποτελεσματικότερη διαχείριση του νοσήματος. Ωστόσο, παρά τα πρώτα ενθαρρυντικά αποτελέσματα στη ΧΛΛ, μικρό ποσοστό των ασθενών επωφελείται μακροπρόθεσμα, υπογραμμίζοντας την ανάγκη για ενδελεχή διερεύνηση της σύστασης και της φυσιολογίας των Τ λεμφοκυττάρων στο μικροπεριβάλλον της νόσου. Στην παρούσα διατριβή εξετάστηκε η διαμόρφωση του ρεπερτορίου της β-αλυσίδας του υποδοχέα των Τ λεμφοκυττάρων (ΤκΥ), η σύσταση του πληθυσμού και η δυναμική των Τ λεμφοκυττάρων σε διαφορετικές ομάδες ασθενών με ΧΛΛ. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε ανοσογενετική ανάλυση των γονιδιακών αναδιατάξεων του ΤκΥ σε ασθενείς που ομαδοποιήθηκαν σύμφωνα με: i) τα χαρακτηριστικά της επιφανειακής ανοσοσφαιρίνης του υποδοχέα των Β λεμφοκυττάρων (ΒκΥ), μεταλλακτικό φορτίο και στερεοτυπία, και ii) διακριτές γενωμικές βλάβες στο γονιδίωμα των ΧΛΛ κυττάρων. Τα αποτελέσματα από την αλληλούχηση ανέδειξαν περιορισμούς στο ρεπερτόριο των Τ λεμφοκυττάρων, και ιδιαίτερα στα CD8+ κύτταρα. Επιπλέον, αναγνωρίστηκαν κοινοί κλωνοτύποι μεταξύ ασθενών της ίδιας προγνωστικής ομάδας ή αποκλειστικά μεταξύ ασθενών με ΧΛΛ, ένδειξη ότι το ρεπερτόριο του ΤκΥ προκύπτει από επιλογή συγκεκριμένων κλώνων από ένα περιορισμένο φάσμα ειδικών αντιγόνων ή/και νέο-αντιγόνων. Ως επιπρόσθετη ένδειξη για την ορθότητα αυτής της υπόθεσης, αναγνωρίστηκαν in silico ειδικοί Τ κλωνοτύποι έναντι ανοσογόνων επιτόπων που προέκυψαν από σημειακές μεταλλάξεις στα γονίδια TP53 και NOTCH1 στις αντίστοιχες ομάδες ασθενών. Στη συνέχεια, αντίστοιχη διαχρονική ανάλυση του ρεπερτορίου εφαρμόστηκε και σε ασθενείς με ΧΛΛ πριν από την έναρξη και κατά τη λήψη θεραπείας με ανοσοχημειοθεραπεία ή νέους στοχευτικούς παράγοντες, όπως αναστολείς της σηματοδότησης μέσω του ΒκΥ ή αναστολέα της αντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης BCL-2, ώστε να διερευνηθεί η επίπτωση των διαφορετικών θεραπειών στη διαμόρφωση του ρεπερτορίου. Συνολικά, τα πειράματα ανέδειξαν δυναμική αλλαγή των μνημονικών Τ λεμφοκυττάρων προς ενεργοποιημένα δραστικά μνημονικά Τ λεμφοκύτταρα σε ασθενείς με ύφεση νόσου μετά από θεραπεία με αναστολείς, η οποία συνοδεύτηκε από ταυτοποίηση κλωνοτύπων οι οποίοι διατηρούνταν από τους νέους παράγοντες και εκπτύσσονταν ανάλογα με το βάθος της κλινικής ανταπόκρισης. Τέλος, πειράματα συνεστιακής μικροσκοπίας και αλληλούχησης του μεταγραφώματος ανέδειξαν λειτουργική αποκατάσταση των Τ λεμφοκυττάρων μετά τη θεραπεία, καθώς βρέθηκαν να αναστρέφουν βασικές βλάβες στα Τ κύτταρα. Οι αναστολείς σηματοδότησης οδήγησαν σε βελτίωση της λειτουργικότητας της άνοσης σύναψης μεταξύ Τ και λευχαιμικών κυττάρων, ενώ ο αναστολέας της BCL-2 οδήγησε σε αλλαγή του προφίλ έκφρασης των CD8+ κυττάρων με μείωση της έκφρασης μορίων που συμμετέχουν σε μονοπάτια με ανοσοκατασταλτική δράση. Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα παραπάνω, η παρούσα διδακτορική διατριβή παρουσιάζει ισχυρές ενδείξεις για την ανάπτυξη ειδικών αντι-λευχαιμικών Τ λεμφοκυττάρων σε ασθενείς με ΧΛΛ ως απόκριση σε νέο-αντιγόνα του λευχαιμικού κλώνου. Αυτά τα κύτταρα μπορεί να επωφελούνται από διαφορετικές θεραπείες αναστρέφοντας τις λειτουργικές βλάβες που έχουν περιγραφεί στη ΧΛΛ, υποστηρίζοντας τις σύγχρονες προσπάθειες για στρατολόγηση του ανοσοποιητικού συστήματος έναντι των ΧΛΛ κυττάρων και άρση των μηχανισμών ανοχής για τον περιορισμό του νοσήματος μέσα από ανοσοθεραπεία διαμεσολαβούμενη από ειδικά Τ λεμφοκύτταρα.