H απόκριση σε βλάβες του DNA σε ανθρώπινα ωοκύτταρα

Abstract

Introduction: Several endogenous and exogenous environmental factors affect cell physiology and homeostasis, causing DNA damage and genome instability. If DNA damages occur in the germline cells, they can potentially lead to infertility, abnormal embryo development and adverse obstetrical, perinatal, and neonatal outcomes. Mammalian oocyte response to DNA damage is of great interest, considering that the female germ cells are produced prior to birth and remain arrested at the prophase stage of meiosis I over a long period of time till puberty. During this extensive state of arrest oocytes may be exposed to several DNA damaging factors, affecting oocyte quality and competence. Therefore, it is of great importance to understand how these cells respond to DNA damage. Despite the significant research in the field started more than three decades ago, information is mostly provided by animal studies and limited data are available in humans.Aim: The aim of the present study was to investigate DNA damage response mechanisms in fully grown germinal vesicle (GV) stage human oocytes, focusing on double strand brakes (DSBs). To elaborate on that, this study investigated the sensitivity of the DNA damage response mechanisms during meiosis on different levels of genotoxicity, the oocyte ability to resume meiosis even with DNA damages, the oocyte capacity on repairing DNA damage as well as the effect of DNA damage on oocyte morphokinetic characteristics during in vitro maturation.Materials & Methods: The present prospective interventional study was conducted on the Laboratory of Cellular and Developmental Biology of the Department of Biological Applications and Technology of the University of Ioannina, in collaboration with the Assisted Reproduction Unit of the ‘’Institute of Life, IASO’’. Study’s protocol was approved by the Greek National Authority of Assisted Reproduction (Approval Number 443/31.7.2018). The population of the study constituted of 24 women till 35 years old, subjected to donor oocyte cycles. Participants received extensive consultation and provided their GV oocytes for the study’s proposes following informed consent. The total number of the donated GV oocytes was 158. Briefly, all participants received the standard short GnRH antagonist protocol. Following oocyte retrieval, the cumulus oocyte complexes (COCs) were mechanically and enzymatically (hyaluronidase, FertiPro) denudated, and the nuclear maturation status was assessed. The isolated GV oocytes were allocated in two groups, the experimental group, and the control group, respectively. The experimental group consisted of GV oocytes which were cultured for one hour in media supplemented with the genotoxic factor etoposide (Etop). Etoposide is a well-known chemical factor, which can induce the formation of DSBs. The control group consisted of GV oocytes which were exposed to the standard culture conditions without etoposide supplementation. Then, some of the GV oocytes of both groups were fixated with paraformaldehyde (PF) (Etop PF and Control PF, respectively), aiming to evaluate etoposide’s effect on inducing DSBs. The rest of the GV oocytes were cultured for 24 hours in benchtop incubators (Astec Pengium, Astec) employing the following culture conditions 6.5% CO2, 5% O2 and temperature 37.5 οC. In order to investigate the effect of etoposide pre-treatment on oocyte in vitro maturation, data obtained from time-lapse (TL) system (Primo Vision, TK Biotech, Vitrolife) were analyzed (Etop TL). Employing the same experimental process, control GV oocytes, without previous exposition on etoposide, were culture and in vitro maturation was also monitored via time-lapse (Control TL). Following culture completion, the oocytes from both groups were fixated, as previously described, in order to assess the competent of the human oocytes to restore DNA damages. Evaluation of DNA damage response was performed employing immunofluorescence experiments, targeting the phosphorylated histone γ-Η2ΑΧ. Histone γ-Η2ΑΧ is a well-known sensitive biomarker for accurately detecting DSBs. The histone γ-Η2ΑΧ immunofluorescent levels were assessed by using confocal microscopy (Leica TCS SP5). Statistical analysis was performed by using GraphPad Prism and the R Language for Statistical Proposes.Results: Aiming to investigate the sensitivity of the DNA damage response mechanisms during the prophase of the 1st meiotic division as well as during metaphase I (MI) stage, 31 GV oocytes were exposed to different concentrations of etoposide (Etop), which can induce different levels of genotoxic damage and then were cultured in order to in vitro maturate for 24 hours, employing incubators equipped with time-lapse systems (TL). More specifically, eight (8) GV oocytes were exposed on 100 μg/ml of etoposide (Etop 100 TL), seven (7) on 20 μg/ml (Etop 20 TL), and seven (7) on 10 μg/ml (Etop 20 TL), triggering severe, mild, and minimal levels of genotoxicity, respectively. Nine (9) GV oocytes were cultured without previous exposure to etoposide and served as the control group (Control TL). Data obtained from time-lapse were analyzed and analysis revealed that the in vitro maturation of the oocytes in the Etop 100 TL group was arrested in the GV stage, as the 100% of these oocytes remained in the GV stage. In contrast, the germinal vesicle breakdown rate (GVBD rate) with regards to the Etop 20 TL and Etop 10 TL groups was recorder to be 71.43% and the 1st polar body extrusion rate (PB1 extrusion rate) was recorder to be 71.43% and 57.14%, respectively. Similar GVBD and PB1 extrusion rates were recorder for the control group, reaching 88.89%, respectively. This data demonstrates that the DNA damage response mechanisms during meiosis of human oocytes are sensitive for extensive genotoxic damages and activate upon severe damage resulting on arresting extensively damaged oocytes on the GV stage. In contrast, mild or minimal damages do not activate the DNA damage response mechanisms, which are insensitive to restricted damages and thus oocytes presenting with these levels of DNA damage are able to successfully maturate. Aiming to further elaborate and verify these conclusions regarding the lack of sensitivity of the DNA damage response mechanisms on detecting mild DNA damages, experiments on larger oocyte population were performed. Briefly, 102 GV human oocytes were recruited in this stage of the study. Forty-five (45) of them were exposed to 20 μg/ml of etoposide (Etop) and then were cultured to in vitro maturate for 24 hours in incubators equipped with time-lapse systems (TL), serving as the experimental group (Etop TL). The rest 57 GV oocytes were cultured under the same conditions to in vitro maturate without previous exposure to etoposide, constituting the control group (Control TL). It is crucial to highlight that prior to these experiments, the ability of 20 μg/ml etoposide on inducing mild damages in the form of DSBs was assessed employing immunofluorescence experiments, targeting the phosphorylated histone γ-Η2ΑΧ. Statistical analysis did not reveal any significant difference between the Etop TL and Control TL groups with regards to both GVBD (62.22% vs 63.16%, p-value = 0.543) and PB1 extrusion rates (85.71% vs 88.89%, p-value = 0.495). In addition, no statistically significant difference was observed between the two groups regarding the time required for both GVBD (5.86 ± 3.19 hours vs 5.89 ± 3.71 hours, p-value = 0.792) and PB1 extrusion (18.32 ± 2.70 hours vs 17.96 ± 3.66 hours, p-value = 0.914), indicating that DNA damage did not affect the transition time from the GV stage to the metaphase II (MII) stage. These data are in the same line with the data originated from the previously described titration experiments, supporting the hypothesis that DNA damage response mechanisms of human oocytes are insensitive to minimal and/or mild levels of genotoxic damage. The effect of DNA damage to oocyte morphology was also assessed. Interestingly, a statistically significant increased rate of oocytes with abnormal morphological features, and especially with granule ooplasm, was observed in the Etop TL group compared with the Control TL group (55.56% vs 29.82%, p-value = 0.015). This increased rate of morphologically abnormal oocytes in the Etop TL group was recorded for both oocytes remained arrested in the GV stage and oocytes successfully reached MII stage. These findings indicate that DNA damage in human oocytes may be associated with abnormal morphological features. A subgroup analysis according to the oocyte donors’ age was performed, in order to investigate the possible effect of maternal age on DDCs sensitivity during oocyte maturation. The first subgroup consisted of GV oocytes retrieved from donors with age ≤ 30 years old. The second subgroup consisted of GV oocytes retrieved from donors with age > 30 years old. No statistically significant difference was observed between and within subgroups with regards to all morphokinetic data analyzed. Finally, the ability of the human oocytes to repair DNA damage, focusing on DSBs, was investigated. Following the 24 hours in vitro culture, a significant reduction of γ-Η2ΑΧ immunofluorescence levels was observed in GV-arrested oocytes previously exposed to etoposide. However, these levels remained statistically significant increase in comparison to the respective GV-arrested oocyte of the control group, which were never exposed to etoposide. These findings indicate that human oocytes can partially restore DNA damage during meiosis.Conclusions: The findings of the present study are in the same line with previously published data, mainly originating from animal studies, and indicate that human GV oocytes can successfully complete maturation from the GV to the MII stage, even if they are carrying DNA damage. This is attributed to the low sensitivity of DNA damage response mechanisms of the human oocytes during meiosis, which on one hand can effectively arrest oocyte maturation in the presence of severe and extensive DNA damage, but on the other hand cannot prevent maturation when DNA damage is mild or minimal due to low sensitivity. However, even the mild DNA damage can cause genome instability, jeopardizing oocyte quality and competence as well as embryo developmental potential. Regarding the ability of human oocytes to repair DNA damage, it seems that it is restricted, and it is taking place mainly via homologous recombination (HR). However, it should be noted that DNA repair is not mandatory for the successful completion of oocyte maturation, as indicated by the fact that MII oocytes, previously damaged at the GV stage, are still carrying DNA lesions. Moreover, this study highlights for first time in literature that human oocytes characterized by abnormal morphological features, and especially by granular cytoplasm, are more likely to carry DNA damage, even if reach MII stage. However, robust data are needed to verify these conclusions. Future studies employing high-throughput techniques, including OMICs and artificial intelligence, are needed in order to deeply understand human oocyte response to DNA damage in both cellular and molecular levels.

Εισαγωγή: Τα κύτταρα του οργανισμού υφίσταται συνεχώς την επίδραση ενδογενών και εξωγενών γενοτοξικών παραγόντων, οι οποίοι μπορούν να προκαλέσουν βλάβες στο DNA και γονιδιωματική αστάθεια. Όταν οι βλάβες στο DNA αφορούν τα κύτταρα της γαμετικής σειράς, τότε αυτό μπορεί να οδηγήσει σε υπογονιμότητα, μη φυσιολογική εμβρυϊκή ανάπτυξη, καθώς και να επηρεάσει αρνητικά τα μαιευτικά και περιγεννητικά αποτελέσματα. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η απόκριση των ωοκυττάρων σε βλάβες του DNA, δεδομένου πως τα κύτταρα αυτά σχηματίζονται κατά την εμβρυϊκή ζωή και παραμένουν στο στάδιο της πρόφασης της 1ης μειωτικής διαίρεσης έως και την εφηβεία. Κατά τη διάρκεια αυτής της μεγάλης περιόδου τα ωοκύτταρα εκτίθενται σε βλάβες του DNA, οι οποίες μπορούν να επηρεάσουν την ποιότητα και το δυναμικό τους. Για τον λόγο αυτό η μελέτη της απόκρισης των ωοκυττάρων σε βλάβες του DNA είναι σημαντική. Αν και το θέμα αυτό απασχολεί την επιστημονική κοινότητα εδώ και τουλάχιστον τρεις δεκαετίες, τα υπάρχοντα δεδομένα προέρχονται κυρίως από μελέτες σε ζωικά μοντέλα, καθιστώντας τις μελέτες σε ανθρώπινα ωοκύτταρα αναγκαίες. Σκοπός: Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της απόκρισης ανθρώπινων ωοκυττάρων που βρίσκονται στο στάδιο του βλαστικού κυστιδίου (germinal vesicle, GV) σε βλάβες του DNA και συγκεκριμένα σε βλάβες της κατηγορίας των δίκλωνων θραυσμάτων του DNA (double strand breaks, DSBs). Απώτερος σκοπός ήταν η διερεύνηση της ευαισθησίας των σημείων ελέγχου για βλάβες του DNA κατά τα διάφορα στάδια της μείωσης, η διερεύνηση του εάν και τα πόσον τα ωοκύτταρα που φέρουν βλάβες στο DNA μπορούν να ολοκληρώσουν την μείωση έχοντας βλάβες, η διερεύνηση του δυναμικού επιδιόρθωσης της βλάβης κατά τη μείωση και η διερεύνηση της πιθανής επίδρασης της βλάβης στα μορφοκινητικά χαρακτηριστικά των ωοκυττάρων στο πλαίσιο της in vitro ωρίμανσής τους.Υλικά & Μέθοδοι: Η παρούσα προοπτική μελέτη παρέμβασης πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Κυτταρικής και Αναπτυξιακής Βιολογίας του Τμήματος Βιολογικών Εφαρμογών και Τεχνολογιών του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, σε συνεργασία με τη Μονάδα Ιατρικώς Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής ‘’Institute of Life’’ που εδρεύει στο Μαιευτήριο ‘’ΙΑΣΩ’’. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Εθνική Αρχή Ιατρικώς Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής (Αρ. Απόφασης 443/31.7.2018). Στη μελέτη συμμετείχαν 24 δότριες ωαρίων ηλικίας έως 35 ετών, οι οποίες υποβλήθηκαν σε κύκλο δωρεάς ωαρίων και για τους σκοπούς της έρευνας δώρισαν 158 GV ωοκύτταρα μετά από προφορική και έγγραφη συναίνεσή τους. Πιο αναλυτικά, όλες οι συμμετέχουσες στη μελέτη έλαβαν ως πρωτόκολλο διέγερσης το συμβατικό βραχύ πρωτόκολλο του ανταγωνιστή της GnRH (short GnRH antagonist protocol). Μετά την ωοληψία πραγματοποιήθηκε μηχανική και ενζυμική (hyaluronidase, FertiPro) απογύμνωση του συμπλέγματος των κοκκιωδών κυττάρων του ωοφόρου δίσκου (COCs) και τα ωοκύτταρα ελέγχθηκαν για το βαθμό της πυρηνικής τους ωριμότητας. Τα ωοκύτταρα σταδίου GV χωρίστηκαν σε δύο ομάδες, στην πειραματική ομάδα και στην ομάδα ελέγχου. Στην πειραματική ομάδα τα GV ωοκύτταρα επωάστηκαν για μία ώρα σε καλλιεργητικό υλικό εμπλουτισμένο με ετοποσίδη (Etop) με σκοπό την πρόκληση DSBs. Τα GV ωοκύτταρα της ομάδας ελέγχου (Control) δεν εκτέθηκαν σε ετοποσίδη. Στη συνέχεια, μερικά από τα GV ωοκύτταρα και των δύο ομάδων μονιμοποιήθηκαν με τη χρήση παραφολμαδεΰδης (Etop PF και Control PF, αντίστοιχα) για να αξιολογηθεί η επίδραση της ετοποσίδης στην πρόκληση DSBs. Τα υπόλοιπα GV ωοκύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κατάλληλο επιτραπέζιο κλίβανο (benchtop) Astec Pengium (Astec) σε συνθήκες καλλιέργειας 6.5% CO2, 5% O2 και θερμοκρασία 37.5 οC για 24 ώρες. Προκειμένου να διερευνηθεί η επίδραση της ετοποσίδης στην in vitro ωρίμανση των GV ωοκυττάρων πραγματοποιήθηκε ανάλυση των μορφοκινητικών δεδομένων με τη χρήση του ψηφιακού ανεστραμμένου μικροσκοπίου τεχνολογίας time-lapse (TL) ‘’Primo Vision’’ (TK Biotech, Vitrolife) (Etop TL). Εφαρμόζοντας τα ίδια πρωτόκολλα ανάλυσης αξιολογήθηκαν τα μορφοκινητικά δεδομένα της in vitro ωρίμανσης των GV ωοκυττάρων της ομάδας ελέγχου τα οποία δεν εκτέθηκαν σε ετοποσίδη (Control TL). Μετά το πέρας της καλλιέργειας τα ωοκύτταρα μονιμοποιήθηκαν προκειμένου να διερευνηθεί η δυναμική επιδιόρθωσης βλαβών στο DNA. Τα πειράματα ανάλυσης των DSBs πραγματοποιήθηκαν μέσω της μελέτης του ανοσοφθορισμού της ιστόνης γ-H2AX, η οποία αποτελεί ειδικό βιοδείκτη της παρουσίας DSBs, με τη χρήση συνεστιακού μικροσκοπίου (Leica TCS SP5). Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του προγράμματος GraphPad Prism (έκδοση 8.4.3) και της Γλώσσας Προγραμματισμού R για Στατιστικούς Σκοπούς.Αποτελέσματα: Προκειμένου να μελετηθεί η ευαισθησία των μηχανισμών ελέγχου για βλάβες του DNA κατά τη πρόφαση της 1ης μειωτικής διαίρεσης και κατά τη φάση ΜΙ, 31 GV ωοκύτταρα εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις ετοποσίδης (Etop) που προκαλούν διαφορετικά επίπεδα γενοτοξικής βλάβης και στη συνέχεια αφέθηκαν να ωριμάσουν για 24 ώρες σε κλίβανο με ενσωματωμένο σύστημα time-lapse (TL). Πιο αναλυτικά, οκτώ (8) GV ωοκύτταρα εκτέθηκαν σε συγκέντρωση ετοποσίδης 100 μg/ml (Etop 100 TL), επτά (7) σε συγκέντρωση ετοποσίδης 20 μg/ml (Etop 20 TL), επτά (7) σε συγκέντρωση ετοποσίδης 10 μg/ml (Etop 10 TL), που προκαλούν εκτεταμένα, μέτρια και ήπια επίπεδα βλάβης, αντίστοιχα, ενώ εννέα (9) δεν εκτέθηκαν σε ετοποσίδη και λειτούργησαν ως ομάδα ελέγχου (Control TL). Τα αποτελέσματα της ανάλυσης των δεδομένων από το σύστημα time-lapse κατέδειξαν πως η ωρίμανση των ωοκυττάρων της ομάδας Etop 100 TL διακόπηκε στο στάδιο GV στο σύνολο (100%) των ωοκυττάρων της ομάδας αυτής. Σε αντίθεση με τα ωοκύτταρα της ομάδας Etop 100 TL, στα ωοκύτταρα των ομάδων Etop 20 TL και Etop 10 TL παρατηρήθηκε διάσπαση βλαστικού κυστιδίου (germinal vesicle breakdown, GVBD) σε ποσοστό 71.43% και σχηματισμός και αποβολή 1ου πολικού σωματίου (polar body extrusion, PBE) σε ποσοστά 71.43% και 57.14%, αντίστοιχα. Τα ποσοστά αυτά ήταν παρόμοια με τα αντίστοιχα ποσοστά που καταγράφηκαν στην ομάδα ελέγχου (Control TL), όπου το ποσοστό διάσπασης βλαστικού κυστιδίου (GVBD rate) ήταν 88.89% και το ποσοστό σχηματισμού και αποβολής 1ου πολικού σωματίου (PB1 extrusion rate) ήταν επίσης 88.89%. Τα δεδομένα αυτά καταδεικνύουν πως τα ανθρώπινα ωοκύτταρα διαθέτουν μηχανισμούς ελέγχου για βλάβες του DNA, οι οποίοι είναι ευαίσθητοι και ενεργοποιούνται εμποδίζοντας την περαιτέρω ωρίμανση των ωοκυττάρων σε εκτεταμένα επίπεδα βλάβης, χωρίς όμως να είναι ευαίσθητοι σε επίπεδα μέτριας ή/και ήπιας βλάβης, επιτρέποντας έτσι την ωρίμανση ωοκυττάρων που φέρουν βλάβες στο DNA. Με σκοπό την επιβεβαίωση της έλλειψης ευαισθησίας των μηχανισμών ελέγχου σε μέτρια επίπεδα βλάβης του DNA, επαναλήφθηκε η παραπάνω πειραματική διαδικασία σε 102 GV ωοκύτταρα, 45 εκ των οποίων εκτέθηκαν σε 20 μg/ml ετοποσίδης (Etop TL) και στη συνέχεια αφέθηκαν να ωριμάσουν για 24 ώρες σε κλίβανο με ενσωματωμένο σύστημα time-lapse (TL) και σε 57 GV ωοκύτταρα τα οποία δεν εκτέθηκαν σε ετοποσίδη και λειτούργησαν ως ομάδα ελέγχου (Control TL). Της ανάλυσης είχαν προηγηθεί πειράματα ανοσοφθορισμού της φωσφορυλιωμένης ιστόνης γ-Η2ΑΧ και συνεστιακής μικροσκοπίας για την επιβεβαίωση της γενοτοξικής επίδρασης της ετοποσίδης σε συγκέντρωση 20 μg/ml. Η στατιστική ανάλυση δεν έδειξε σημαντικές διαφορές μεταξύ της πειραματικής ομάδας (Etop TL) και της ομάδας ελέγχου (Control TL) αναφορικά με τα ποσοστά διάσπασης βλαστικού κυστιδίου (GVBD rate 62.22% vs 63.16%, p-value = 0.543) και σχηματισμού και αποβολής 1ου πολικού σωματίου (PB1 extrusion rate 85.71% vs 88.89%, p-value = 0.495). Επιπρόσθετα, και οι χρόνοι επίτευξης της διάσπασης του βλαστικού κυστιδίου (GVBD time 5.86 ± 3.19 ώρες vs 5.89 ± 3.71 ώρες, p-value = 0.792) και του σχηματισμού και αποβολής του 1ου πολικού σωματίου (PB1 extrusion 18.32 ± 2.70 ώρες vs 17.96 ± 3.66 ώρες, p-value = 0.914), οι οποίοι αντικατοπτρίζουν τον χρόνο μετάβασης από το στάδιο GV στο στάδιο MII, δεν διέφεραν μεταξύ των ομάδων. Τα δεδομένα αυτά επιβεβαιώνουν την παραπάνω υπόθεση περί έλλειψης ευαισθησίας των μηχανισμών ελέγχου σε μέτρια επίπεδα γενοτοξικής βλάβης. Στη συνέχεια, αξιολογήθηκε η πιθανή επίδραση της ετοποσίδης και της γενοτοξικής βλάβης που αυτή προκαλεί στα μορφολογικά χαρακτηριστικά των ωοκυττάρων. Στην πειραματική ομάδα (Etop TL) παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντικά υψηλότερο ποσοστό ωοκυττάρων που είχαν μη φυσιολογική μορφολογία και πιο ειδικά κοκκιώδες κυτταρόπλασμα (55.56%, 25/45) σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Control TL) (29.82%, 17/57) (p-value = 0.015), καταδεικνύοντας πως ίσως οι βλάβες στο DNA σχετίζονται με μη φυσιολογικά μορφολογικά πρότυπα. Επίσης, πραγματοποιήθηκε ανάλυση υποομάδων με βάση την ηλικία των δοτριών, προκειμένου να διερευνηθεί το εάν και τα πόσον η ηλικία μπορεί να επηρεάσει την ευαισθησία των μηχανισμών ελέγχου βλαβών του DNA κατά την ωρίμανση των ωοκυττάρων. Στην μία υποομάδα συμπεριελήφθησαν GV ωοκύτταρα που συλλέχθηκαν από δότριες ηλικίας ≤ 30 ετών και στην άλλη υποομάδα συμπεριελήφθησαν GV ωοκύτταρα που συλλέχθηκαν από δότριες ηλικίας > 30 ετών. Η στατιστική ανάλυση δεν έδειξε σημαντικές διαφορές μεταξύ των υποομάδων αναφορικά με τα δεδομένα της μορφοκινητικής ωρίμανσης των ωοκυττάρων. Τέλος διερευνήθηκε η ικανότητα επιδιόρθωσης των DSBs που παρουσιάζουν τα ανθρώπινα GV ωοκύτταρα. Τα δεδομένα της στατιστικής ανάλυσης έδειξαν πως τα ωοκύτταρα σταδίου GV που εκτέθηκαν σε ετοποσίδη διαθέτουν μερική επιδιορθωτική ικανότητα των DSBs, καθώς ο εκπεμπόμενος ανοσοφθορισμός της γ-Η2ΑΧ παρουσιάστηκε στατιστικά σημαντικά χαμηλότερος μετά την καλλιέργεια σε σύγκριση με τον ανοσοφθορισμό αμέσως μετά την έκθεση σε ετοποσίδη και στατιστικά σημαντικά υψηλότερος σε σύγκριση με τον εκπεμπόμενο ανοσοφθορισμό από τα GV ωοκύτταρα της ομάδας ελέγχου. Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής συμφωνούν με την πλειονότητα των βιβλιογραφικών δεδομένων που αφορούν κυρίως μελέτες σε ζωικά μοντέλα και δείχνουν πως τα ανθρώπινα ωοκύτταρα σταδίου GV που φέρουν βλάβες στο DNA τους μπορούν να ολοκληρώσουν επιτυχώς την ωρίμανσή τους έως και το στάδιο MII. Αυτό οφείλεται στην χαμηλή ευαισθησία των μηχανισμών ελέγχου για βλάβες του DNA κατά τη μείωση, οι οποίοι προκαλούν αναστολή της ωρίμανσης των ωοκυττάρων όταν οι βλάβες είναι εκτεταμένες, χωρίς να ισχύει το ίδιο για βλάβες περιορισμένης έκτασης, οι οποίες όμως εν δυνάμει μπορούν να προκαλέσουν γονιδιωματική αστάθεια, επηρεάζοντας δυσμενώς το δυναμικό ανάπτυξης των ωοκυττάρων, καθώς και την μετέπειτα εμβρυϊκή ανάπτυξη. Αναφορικά με την επιδιορθωτική ικανότητα των ωοκυττάρων, αυτή είναι περιορισμένη και συντελείται κυρίως μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού (homologous recombination, HR). H επιδιόρθωση της βλάβης δεν είναι συνθήκη ούτε αναγκαία, ούτε ικανή για την συνέχιση της ωρίμανσης των ωοκυττάρων, κάτι που σημαίνει πως πλήρως ώριμα ωάρια σταδίου MII μπορούν να φέρουν σημαντικές βλάβες στο DNA. Επίσης, φαίνεται πως τα ωοκύτταρα που φέρουν βλάβες στο DNA είναι πιο πιθανό να παρουσιάζουν μη φυσιολογικά μορφολογικά χαρακτηριστικά, ακόμα και εάν επιτύχουν ωρίμανση έως το στάδιο MII. Ωστόσο η παρατήρηση αυτή πρέπει να διερευνηθεί προκειμένου να εξαχθούν ασφαλή συμπεράσματα. Μελλοντικές μελέτες απαιτούνται προκειμένου να διερευνηθεί σε βάθος η απόκριση των ωοκυττάρων του ανθρώπου σε βλάβες στο DNA, τόσο σε μοριακό, όσο και σε κυτταρικό επίπεδο.