Ρύθμιση βιοσύνθεσης υαλουρονικού οξέος σε κυτταρικά μοντέλα καρκίνου του μαστού

Abstract

Breast cancer is one of the most common types of cancer occurring in women. It is a highly heterogeneous disease and, for thereapeutical reasons, is classified as –estrogen-dependent or -independent breast cancer. One of the most important clinical markers for breast cancer classification is the estrogen receptor α (ERα). Importantly, about 70% of breast cancers are diagnosed as ERα+ and exhibit better patient outcome than ERα- tumors, which exhibit high incidence of metastases and poor patient outcomes. Under pathological conditions, such as cancer, an extended remodeling of the extracellular matrix (ECM) occurs within tissues. An important constituent of the ECM is the linear heteropolysaccharide hyaluronan, which is synthesized by transmembrane enzymes termed hyaluronan synthases (HASes). High concentrations of hyaluronan are correlated with higher incidence of metastasis and poor outcome of patients with breast cancer. Hyaluronan interacts with its cellular receptors, mainly CD44, to regulate almost every aspect of cellular behavior, such as migration, invasion, proliferation, differentiation and metastasis, in breast cancer cells. Given the prominent role of hyaluronan in breast cancer cell biology, this doctorate’s thesis has focused οn the study and characterization of novel hyaluronan biosynthesis inhibitors.4-methyl-umbelliferone (4-MU) is a non-toxic dietary supplement found in plants such as chamomile and has been shown to inhibit hyaluronan production in several cell types. In this doctarate’s study, we hypothesized that estrogen receptor, a major prognostic factor in the clinical evolution and therapeutic management of breast cancer, would provide a differential effect on the biology of breast cancer subtypes vis-à-vis 4-MU treatment. Indeed, 4-MU inhibited hyaluronan production by ERα+ and ERα- breast cancer cells, with a stronger effect being observed in cells lacking ERα expression. Loss of newly synthesized hyaluronan was accompanied by the significant reduction of HAS2 and the hyaluronidases HYAL-1 and HYAL-2 gene expressions. Moreover, 4-MU-treated cells displayed altered cell morphology, accompanied by loss of the hyaluronan receptor CD44 from the cell surface protrusions. Treatment of the cells with 4-MU caused significant reduction in cell proliferation and growth. Different results were observed in the context of cell proliferation between ERα+ and ERα- cells. Specifically, while in ERα+ cells 4-MU induced apoptosis and/or anoikis, in ERα- cells 4-MU likely promoted cell cycle arrest. Furthermore, 4-MU reduced migration and invasion, while upregulated the adhesive potential of breast cancer cells on specific substrates. These observations were accompanied by significant alterations in the expression and activity of specific extracellular matrix-degrading enzymes and pro-inflammatory mediators.Salicylate and acetyl-salicylic acid (aspirin) are widely utilized for many decades as potent anti-inflammatory drugs. In several epidemiological and clinical studies, these compounds displayed significant anti-cancer properties. Nevertheless, the exact underline mechanisms of their anti-cancer action are not yet clarified. This study examined the ability of salicylate -metabolic by-product of aspirin occurring rapidly in vivo by the action of endogenous esterases- to inhibit hyaluronan production by breast cancer cells. Salicylate was found to rapidly activate the kinase AMPK, which is known to phosphorylate and inhibit HAS2, resulting in inhibition of hyaluronan synthesis by metastatic breast cancer cells. Moreover, salicylate reduced HAS2, while upregulated HYAL-2 and CD44. Incubation of breast cancer cells with salicylate caused significant reorganization of the actin cytoskeleton and redistribution of CD44, events that were accompanied by reduction of cell motility. Furthermore, salicylate promoted cell cycle arrest and inhibited cell proliferation. Given the urgent need for discovery of novel and more effective inhibitors of hyaluronan synthases, the ability of a group of compounds to inhibit hyaluronan production was examined. In this study, a new inhibitor of hyaluronan biosynthesis, termed SMD1736, was identified. SMD1736, a thymidine analog, is approximately 12.5-fold more potent from the known inhibitor of hyaluronan synthesis 4-MU. Incubation of metastatic breast cancer cells with SMD1736 significantly affected the expression of hyaluronan related genes (HASes, HYALs, CD44 and RHAMM). The observed reduction of hyaluronan biosynthesis by SMD1736 in breast cancer cells was accompanied by significant inhibition of their aggressive properties. Specifically, SMD1736 reduced cell proliferation, probably through cell cycle arrest. The migratory and invasive potential of breast cancer cells was also reduced by SMD1736, observations that were followed by alterations in the actin cytoskeleton morphology and de-activation of RhoA GTPase. Moreover, a siginificant reduction was observed in the self-renewal of breast cancer stem cells, while severe morphological alterations were observed in cells grown in 3D culture conditions.In conclusion, the present doctorate’s thesis studied and characterized three inhibitors of hyaluronan biosynthesis: 4-MU (in relation to the ER status of the cells), salicylate (the active compound of the classic non-steroid anti-inflammatory drug aspirin) and the new synthetic compound SMD1736. The reduction of hyaluronan levels by all three compounds was accompanied by inhibition of breast cancer cell aggressive properties, pinpointing the significance of hyaluronan system targeting in breast cancer. All three compounds displayed significant effects that make them very promising means for the development of novel matrix-based therapeutic approaches for complex pathologies characterized by extended biosynthesis and accumulation of hyaluronan, such as breast cancer.

Ο καρκίνος του μαστού, ένας από τους πιο συχνά εμφανιζόμενους καρκίνους στις γυναίκες, εμφανίζει μεγάλη φαινοτυπική και γονοτυπική ετερογένεια. Ένας από τους σημαντικούς κλινικούς δείκτες που χρησιμοποιούνται για την κατηγοριοποίηση του καρκίνου του μαστού είναι ο υποδοχέας των οιστρογόνων ERα (Estrogen Receptor α). Το 70% των καρκίνων του μαστού διαγιγνώσκονται ως ERα+ όγκοι και εμφανίζουν καλή πρόγνωση, ενώ στους ERα- όγκους παρατηρείται υψηλό ποσοστό μεταστάσεων και κακή πρόγνωση των ασθενών. Σε παθολογικές καταστάσεις, όπως είναι ο καρκίνος, παρατηρείται έντονη αναδιοργάνωση του εξωκυτταρικού δικτύου μακρομορίων που περιβάλλει τα κύτταρα στους ιστούς. Ένα σημαντικό συστατικό του εξωκυττάριου χώρου είναι το υαλουρονικό, ένας γραμμικός ετεροπολυσακχαρίτης, ο οποίος συντίθεται από διαμεμβρανικά ένζυμα, τις συνθάσες του υαλουρονικού (Hyaluronan Synthases, HASes). Η αυξημένη βιοσύνθεση και συσσώρευση υαλουρονικού στους καρκινικούς ιστούς του μαστού συσχετίζονται με υψηλή πιθανότητα δημιουργίας μεταταστάσεων, αντίσταση στις εφαρμοζόμενες χημειο- και ραδιο-θεραπείες και κακή πρόγνωση των ασθενών. Το υαλουρονικό αλληλεπιδρώντας τόσο με μόρια του εξωκυττάριου χώρου όσο και με τους εξειδικευμένους κυτταρικούς υποδοχείς του, όπως ο CD44, ρυθμίζει σχεδόν όλες τις πτυχές της κυτταρικής συμπεριφοράς, όπως η κυτταρική μετανάστευση, η διήθηση, ο πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση. Με δεδομένο τον σημαντικό ρόλο του υαλουρονικού στη βιολογία των καρκινικών κυττάρων μαστού, η παρούσα διδακτορική διατριβή εστίασε στην ανάδειξη και μελέτη αναστολέων της βιοσύνθεσής του. Το 4-methyl-umbelliferone (4-MU) είναι ένα μη τοξικό διαιτητικό συμπλήρωμα που προέρχεται από φυτά, όπως το χαμομήλι, με επιβεβαιωμένη ανασταλτική δράση έναντι της βιοσύνθεσης υαλουρονικού σε διάφορους τύπους κυττάρων. Υποθέσαμε ότι ο υποδοχέας των οιστρογόνων ERα -ένας σημαντικός προγνωστικός δείκτης στην κλινική διαχείριση και θεραπεία του καρκίνου του μαστού- ρυθμίζει διαφορετικά τη βιολογία των καρκινικών κυττάρων μαστού μετά από την επώασή τους με 4-MU. Πράγματι, το 4-MU ανέστειλε τη βιοσύνθεση του υαλουρονικού στα ERα+ και ERα- καρκινικά κύτταρα μαστού, με την ισχυρότερη δράση να παρατηρείται στα κύτταρα που δεν εκφράζουν τον υποδοχέα ERα. Η μείωση του νεο-συντιθέμενου υαλουρονικού συνοδεύτηκε από μεταβολές στα ένζυμα μεταβολισμού του και συγκεκριμένα ελάττωση της συνθάσης HAS2 και επαγωγή των υαλουρονιδασών HYAL-1 και HYAL-2. Επιπλέον, το 4-MU προκάλεσε σημαντικές μορφολογικές αλλαγές, οι οποίες συνοδεύονταν από απώλεια του υποδοχέα του υαλουρονικού CD44 από τις κυτταρικές προεκβολές. Σε λειτουργικό επίπεδο, η επώαση των κυττάρων με 4-MU προκάλεσε σημαντική μείωση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη. Αξίζει να σημειωθεί ότι παρατηρήθηκαν διαφορετικές επιδράσεις του 4-MU σε καρκινικά κύτταρα μαστού με διαφορετικό προφίλ έκφρασης του ERα. Στα ERα+ κύτταρα, το 4-MU προκάλεσε την επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης ή/και anoikis, ενώ στα ERα- κύτταρα πιθανώς οδήγησε σε στάση του κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον, το 4-MU ανέστειλε τη μετανάστευση και διήθηση των μεταστατικών ERα- καρκινικών κυττάρων μαστού, ενώ προκάλεσε αύξηση της προσκόλλησής τους σε εξωκυττάριο υπόστρωμα, παρατηρήσεις που συνοδεύτηκαν από σημαντικές μεταβολές στην έκφραση ενζύμων αποικοδόμησης του εξωκυττάριου χώρου και προ-φλεγμονωδών διαμεσολαβητών. Το σαλικυλικό και το ακετυλο-σαλικυλικό (ασπιρίνη) χρησιμοποιούνται εδώ και πολλά χρόνια ως αντιφλεγμονώδη φάρμακα. Παράλληλα, σύμφωνα με πρόσφατες επιδημιολογικές και κλινικές μελέτες, εμφανίζουν σημαντικές αντικαρκινικές ιδιότητες. Παρότι ο ρόλος τους και η δράση τους στη φλεγμονή έχει αποσαφηνιστεί, ο ακριβής μηχανισμός της αντικαρκινικής τους δράσης δεν είναι πλήρως γνωστός. Στην παρούσα διατριβή, εξετάσθηκε η δράση του σαλικυλικού -το οποίο παράγεται ταχέως in vivo μετά από την ενζυμική αποακετυλίωση της χορηγούμενης ασπιρίνης από εστεράσες- ως αναστολέα βιοσύνθεσης του υαλουρονικού σε μεταστατικά καρκινικά κύτταρα μαστού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το σαλικυλικό είναι ικανό να επάγει την άμεση ενεργοποίηση της κινάσης AMPK, η οποία είναι γνωστό ότι φωσφορυλιώνει και απενεργοποιεί την HAS2, με αποτέλεσμα να αναστέλλεται η βιοσύνθεση και συσσώρευση υαλουρονικού στα καρκινικά κύτταρα μαστού. Η παρατηρούμενη αναστολή φαίνεται να ρυθμίζεται από την επάρκεια θρεπτικών συστατικών στο μικροπεριβάλλον των κυττάρων και από τις ενεργειακές τους ανάγκες. Επιπλέον, το σαλικυλικό επηρέασε την έκφραση μορίων που σχετίζονται με τον μεταβολισμό και τις δράσεις του υαλουρονικού καθώς προκάλεσε μείωση της HAS2 και αύξηση των HYAL-2 και CD44 σε γονιδιακό επίπεδο. Επιπροσθέτως, η επώση των κυττάρων με σαλικυλικό προκάλεσε έντονη υποκυτταρική ανακατανομή του CD44 και αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, παρατηρήσεις που συνοδεύτηκαν από μείωση της μετανάστευσης των μεταστατικών καρκινικών κυττάρων μαστού. Τέλος, τα δεδομένα μας υποστηρίζουν ότι το σαλικυλικό προκαλεί αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης πιθανότατα μέσω στάσης του κυτταρικού κύκλου.Με δεδομένη την ανάγκη ανάπτυξης νέων εκλεκτικών και περισσότερο αποτελεσματικών αναστολέων των συνθασών του υαλουρονικού, εξετάσθηκε η ικανότητα μιας ομάδας νέων συνθετικών χημικών ενώσεων να αναστέλλουν τη βιοσύνθεση του υαλουρονικού. Η παρούσα διατριβή ανέδειξε έναν νέο αναστολέα, τον SMD1736, ο οποίος είναι ένα ανάλογο θυμιδίνης. Ο SMD1736 φαίνεται να είναι κατά περίπου 12.5-φορές δραστικότερος από τον ήδη γνωστό αναστολέα βιοσύνθεσης του υαλουρονικού 4-MU. Η επώαση καρκινικών κυττάρων μαστού με τον SMD1736 προκάλεσε σημαντικές μεταβολές στην έκφραση γονιδίων του συστήματος του υαλουρονικού (HASes, HYALs, CD44 και RHAMM). Περαιτέρω, η μείωση της βιοσύνθεσης του υαλουρονικού από τον SMD1736 συνοδεύτηκε από αναστολή των επιθετικών ιδιοτήτων μεταστατικών καρκινικών κυττάρων μαστού. Συγκεκριμένα, ο SMD1736 προκάλεσε σημαντική μείωση της κυτταρικής ανάπτυξης, πιθανώς επάγοντας στάση του κυτταρικού κύκλου, ενώ σημαντική μείωση παρατηρήθηκε επίσης στο μεταναστευτικό και διηθητικό δυναμικό των κυττάρων. Οι μεταβολές αυτές συνοδεύτηκαν από έντονη αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού και απενεργοποίηση της RhoA GTPάσης. Τέλος, σημαντική μείωση παρατηρήθηκε στην ικανότητα αυτο-ανανέωσης των καρκινικών βλαστικών κυττάρων μαστού, η οποία συνοδεύτηκε και από αλλαγές της μορφολογίας των κυττάρων που αναπτύσσονταν σε συνθήκες 3D, μετά από επώαση με τον SMD1736. Συνοψίζοντας, η διδακτορική αυτή διατριβή ανέδειξε και χαρακτήρισε τρεις αναστολείς βιοσύνθεσης του υαλουρονικού σε καρκινικά κυτταρικά μοντέλα μαστού: το 4-MU (υπό το πρίσμα του διαφορετικού προφίλ έκφρασης οιστρογονοϋποδοχέων), το σαλικυλικό (δραστικό συστατικό ενός κλασσικού και ευρέως χρησιμοποιούμενου αντιφλεγμονώδους φαρμάκου, της ασπιρίνης) και μία νέα χημική ένωση, τον αναστολέα SMD1736. Η μείωση των επιπέδων του παραγόμενου υαλουρονικού και της συσσώρευσής του τόσο εξωκυττάρια όσο και ενδοκυττάρια και από τις τρεις χημικές ενώσεις, συνοδεύτηκε από αξιοσημείωτη αναστολή των επιθετικών ιδιοτήτων των καρκινικών κυττάρων μαστού (ιδιαίτερα των μεταστατικών), αναδεικνύοντας τη σημασία της στόχευσης του συστήματος του υαλουρονικού στον καρκίνο του μαστού. Και οι τρεις αναστολείς που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή εμφανίζουν σημαντική αντικαρκινική δράση, καθιστώντας τους χρήσιμα «εργαλεία» για την ανάπτυξη νέων εκλεκτικών θεραπευτικών προσεγγίσεων έναντι ασθενειών οι οποίες χαρακτηρίζονται από αυξημένη βιοσύνθεση και συσσώρευση υαλουρονικού, όπως είναι ο καρκίνος του μαστού.