The role of important ribonucleases in the regulation of gene expression

Abstract

The intricate and dynamic regulation of gene expression by non-coding RNAs (ncRNAs) is a fundamental aspect of higher eukaryote complexity, which extends beyond the simple quantity of protein-coding genes. Ribonucleases, the enzymes responsible for RNA processing, play a crucial role in this regulation by providing precise and specific activity that shapes the ncRNA landscape. Ribonuclease Z is an enzyme that removes 3’ trailers from precursor tRNAs and is found in all domains of life. This thesis conducts a comparative study on two paralogous forms of human ribonuclease Z, namely ELAC1/RNase ZS (40 kDa) and ELAC2/RNase ZL (92.2 kDa), which diverged early in the evolutionary timeline of eukaryotes. These two ribonucleases, despite originating from a common ancestral gene, evolved specialized roles, providing a valuable window into the intricate processes underpinning eukaryotic complexity. Since its appearance, ELAC2 has the main role in the 3’ processing of nuclear and mitochondrial pre-tRNAs. It is also involved in the maturation of lncRNAs that contain tRNA-like structure like MALAT1 and NEAT1. On the other hand, as it was very recently shown, ELAC1 is implicated in the 3’ repair of mature tRNAs released from stalled ribosomes that bear a 2’-3’ cyclic phosphate in the discriminator base, so that the CCA can be added anew and subsequently aminoacylated. However, the roles of ELAC1 may not be confined to tRNA repair, and considering that ANGEL2 can perform a similar function, it is clear that ELAC1 might have a broader range of roles and functionalities. Previous studies from our group highlighted the dispensability of ELAC1 as we were able to knockout ELAC1 with CRISPR-Cas9, which indicates that ELAC1 may have a more specialized role. ELAC2 on the other hand is essential for viability. Biochemical and structural comparison of these two paralogues showed that ELAC1 and ELAC2 although they seem to recognize similar elements like the tRNA elbow or the length of the acceptor stem, they exhibit distinct substrate specificities and biochemical properties. ELAC2 was found to be more effective and more accurate in the cleavage of 3’ trailers of pre-tRNAs particularly with pre-tRNAs lacking the ability to adopt the appropriate conformation, and ELAC1 demonstrating the capacity to execute the removal of the CCA trinucleotide from mature tRNAs. Structural inquiries using predicted structures generated by AlphaFold, due to the limited availability of eukaryotic crystal structures, revealed significant structural similarities and differences critical for substrate recognition and catalytic activity. The diverse functions of ELAC1 were revealed by mapping its possible interactions with a variety of RNA substrates. CLIP-seq experiments conducted using both wild-type ELAC1 and the catalytically inactive ELAC1-H64A variant revealed that ELAC1 can interact with a broad range of Pol III transcripts, including mature tRNAs, snoRNAs, snRNAs, Y RNAs, with vault RNAs emerging as a major category. This suggests its potential role in mechanisms like drug resistance and innate immunity. In vitro cleavage assays further confirmed exclusive ability of ELAC1 to process non-tRNA transcripts like YRNAs and vtRNAs. These findings highlight the unique substrate specificity of ELAC1, suggesting a wider role in RNA processing than previously assumed. Whole transcriptome and small RNA sequencing unveiled that ELAC1, a critical player in tRNA processing, influences the regulation of protein-coding genes as well as a wide spectrum of non-coding RNAs. Whole transcriptome data corroborate that the impact of ELAC1 encompasses lncRNAs, snoRNAs, snRNAs, vtRNAs, and miscRNAs, offering fresh perspectives on the potential roles of this enzyme. Further, the observed changes in tRNA abundance and diversity under ELAC1 knockout and overexpression conditions underline the significant contribution of ELAC1 to protein translation and tRNA isoacceptor balance. A striking result from this study is the different patterns of tRNA-derived fragment (tRF) expression in ELAC1 knockout, overexpression, and reintroduction scenarios, underscoring the crucial role of ELAC1 in maintaining tRF equilibrium and potentially guiding tRF processing. Moreover, extensive analysis of small-RNAseq data, suggest that ELAC1 regulates the biogenesis of diverse small RNAs, particularly those originating from vtRNAs and YRNAs. This research also indicates the possible role of ELAC1 in regulating the 3' end of RNA polymerase III transcripts, which including the poly U-tract, a critical binding site for La and members of the La-related protein family. The current thesis highlights the divergent functions of ELAC1 and ELAC2 and pinpoints the key role of ELAC1 key role in regulating the biogenesis of several important noncoding RNAs. Characterization of ELAC1 revealed the significant impact on RNA processing and our understanding of the RNA regulatory network and sets the stage for future research into noncoding RNA processing and the complexity of gene expression regulation in higher eukaryotes.

Η περίπλοκη και δυναμική ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης από μη-κωδικοποιητικά RNAs είναι μια θεμελιώδης πτυχή της πολυπλοκότητας των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών, η οποία είναι γνωστό ότι δεν οφείλεται στον αριθμό των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Οι ριβονουκλεάσες, τα ένζυμα που είναι υπεύθυνα για την επεξεργασία του RNA, διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο σε αυτή τη ρύθμιση διαμορφώνοντας το τοπίο των μη-κωδικοποιητικών RNA μέσω της δράσης τους. Η Ριβονουκλεάση Ζ είναι το υπεύθυνο ένζυμο για την απομάκρυνση της 3' ακόλουθης αλληλουχίας από τα πρόδρομα tRNA και βρίσκεται σε όλες τις επικράτειες της ζωής. Η παρούσα διατριβή πραγματοποιεί μια συγκριτική μελέτη σε δύο παράλογες μορφές της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης Ζ, την ELAC1/RNase ZS (40 kDa) και την ELAC2/RNase ZL (92,2 kDa), οι οποίες διαφοροποιήθηκαν νωρίς κατά την εξέλιξη των ευκαρυωτικών οργανισμών και παρά την προέλευσή τους από ένα κοινό προγονικό γονίδιο και έχουν αναπτύξει εξειδικευμένους ρόλους. Από την εμφάνισή της, η ELAC2 έχει τον κύριο ρόλο στην 3' επεξεργασία των πυρηνικών και μιτοχονδριακών πρόδρομων tRNA. Συμμετέχει επίσης στην ωρίμανση μακρών μη-κωδικοποιητικών μορίων RNA (lncRNA) που περιέχουν δομή που προσομοιάζει τα tRNA, όπως τα MALAT1 και NEAT1. Από την άλλη πλευρά, όπως φάνηκε πρόσφατα, η ELAC1 εμπλέκεται στην 3' επιδιόρθωση ώριμων tRNAs που απελευθερώνονται από ακινητοποιημένα ριβοσώματα και φέρουν 2'-3' κυκλικό φωσφορικό στη βάση διαχωριστή, έτσι ώστε να προστεθεί εκ νέου το CCA και στη συνέχεια να αμινοακυλιωθεί. Ωστόσο, οι ρόλοι της ELAC1 μπορεί να μην περιορίζονται στην επιδιόρθωση των tRNA, και λαμβάνοντας υπόψη ότι η ANGEL2 μπορεί να επιτελέσει παρόμοια λειτουργία, είναι σαφές ότι η ELAC1 μπορεί να έχει ένα ευρύτερο φάσμα ρόλων και λειτουργιών. Προηγούμενες μελέτες από την ομάδα μας έχουν αναδείξει ότι η ELAC1 είναι επουσιώδης για το κύτταρο, καθώς μπορέσαμε να απαλείψουμε το γονίδιο ELAC1 με CRISPR-Cas9, γεγονός που υποδεικνύει ότι η ELAC1 μπορεί να έχει έναν πιο εξειδικευμένο ρόλο. Από την άλλη πλευρά, το ELAC2 είναι απαραίτητο για τη βιωσιμότητα. Η βιοχημική και δομική σύγκριση αυτών των δύο παραλόγων έδειξε ότι η ELAC1 και η ELAC2 αν και φαίνεται να αναγνωρίζουν παρόμοια στοιχεία όπως ο η δομή αγκώνας του tRNA (tRNA elbow) ή το μήκος του στελέχους του αποδέκτη (acceptor stem), παρουσιάζουν διαφορετικές ειδικότητες υποστρώματος και βιοχημικές ιδιότητες. Διαπιστώθηκε ότι η ELAC2 είναι πιο αποτελεσματική και ακριβής στη διάσπαση των 3' ακόλουθων αλληλουχιών των πρόδρομων tRNA, ιδιαίτερα με τα πρόδρομα tRNA που δεν έχουν την ικανότητα να υιοθετήσουν την κατάλληλη διαμόρφωση, ενώ η ELAC1 επιδεικνύει την ικανότητα να κόβει το CCA τρινουκλεοτίδιο από τα ώριμα tRNAs. Δομικές έρευνες με τη χρήση προβλεπόμενων δομών προερχόμενες από το AlphaFold αποκάλυψαν σημαντικές δομικές ομοιότητες αλλά και διαφορές, κρίσιμες για την αναγνώριση του υποστρώματος και την καταλυτική δραστηριότητα. Πειράματα CLIP-seq που πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση τόσο της ELAC1 άγριου τύπου όσο και της καταλυτικά ανενεργής παραλλαγής ELAC1-H64A αποκάλυψαν ότι η ELAC1 μπορεί να αλληλεπιδράσει με ένα ευρύ φάσμα μεταγράφων της RNA πολυμεράσης III, συμπεριλαμβανομένων ώριμων tRNAs, snoRNAs, snRNAs, YRNAs, με τα vault RNAs να αναδεικνύονται ως το πιο σημαντικό υπόστρωμα. Αυτό υποδηλώνει τον πιθανό ρόλο της σε μηχανισμούς όπως η αντίσταση στα φάρμακα και η έμφυτη ανοσία. Οι in vitro βιοχημικές δοκιμασίες επιβεβαίωσαν περαιτέρω την ικανότητα της ELAC1 να επεξεργάζεται μετάγραφα πέρα από tRNA, αποκαλύπτοντας διαφορετικά πρότυπα διάσπασης για τις ELAC1 και ELAC2. Ειδικότερα, η ELAC1 έδειξε αποκλειστική επεξεργασία των εξεταζόμενων snRNAs, YRNAs και vtRNAs. Τα ευρήματα αυτά αναδεικνύουν την εξειδίκευση υποστρώματος της ELAC1, υποδηλώνοντας έναν ευρύτερο ρόλο στην επεξεργασία RNA από ότι είχε υποτεθεί προηγουμένως. Η αλληλούχιση ολόκληρου του μεταγραφώματος καθώς και των μικρών RNA μορίων αποκάλυψε ότι η ELAC1 επηρεάζει τη ρύθμιση των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες καθώς και ένα ευρύ φάσμα μη-κωδικοποιητικών RNA. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι τo φάσμα πιθανών υποστρωμάτων της ELAC1 περιλαμβάνει lncRNAs, snoRNAs, snRNAs, vtRNAs και miscRNAs, προσφέροντας νέες προοπτικές για τους πιθανούς ρόλους αυτού του ενζύμου. Ένα εντυπωσιακό αποτέλεσμα αυτής της μελέτης είναι τα διαφορετικά πρότυπα έκφρασης των θραυσμάτων που προέρχονται από tRNA (tRF) σε συνθήκες knockout, υπερέκφρασης και επανεισαγωγής του ELAC1 σε knockout κύτταρα, υπογραμμίζοντας τον κρίσιμο ρόλο της ELAC1 στη διατήρηση της ισορροπίας των tRF και ενδεχομένως στην καθοδήγηση της επεξεργασίας αυτών. Επιπλέον, η εκτεταμένη ανάλυση δεδομένων small-RNAseq, υποδηλώνει ότι η ELAC1 ρυθμίζει τη βιογένεση διαφόρων μη-κανονικών μικρών RNAs, ιδίως εκείνων που προέρχονται από vtRNAs και YRNAs. Η έρευνα αυτή υποδεικνύει επίσης τον πιθανό ρόλο της ELAC1 στη ρύθμιση του 3' άκρου των μεταγράφων της RNA πολυμεράσης ΙΙΙ, το οποίο περιλαμβάνει το poly U-tract, μια κρίσιμη θέση πρόσδεσης για τη La και τα μέλη της οικογένειας των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τη La (La-related proteins). Η παρούσα διατριβή διερευνά τις αποκλίνουσες λειτουργίες των ELAC1 και ELAC2 και παρουσιάζει τον σημαντικό ρόλο της ELAC1 στη ρύθμιση της βιογένεσης πολλών σημαντικών μη-κωδικοποιημένων RNAs. Ο χαρακτηρισμός της ELAC1 ανέδειξε τη σημαντική επίδραση στην επεξεργασία RNA και στην κατανόηση του ρυθμιστικού δικτύου RNA και θέτει τις βάσεις για μελλοντική έρευνα σχετικά με την επεξεργασία μη-κωδικοποιητικών RNA και την πολυπλοκότητα της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς.