Functional importance and molecular characterization of differentially methylated regions in helper T cell subsets

Abstract

Heritable epigenetic modifications play an essential role in CD4+ T helper cell (Th) differentiation processes. Here, we unraveled the methylome of human naive, Th1, Th17 and non-classic Th1 cells by performing a whole-genome bisulfite sequencing analysis (WGBS). Epigenetic characterization of each subset was performed and differentially methylated regions (DMRs) were revealed serving as T cell-specific epigenetic signatures. Uniquely demethylated regions in Th17 cells were detected in genes like IL-17A, RORC, HNRNPLL, ZBTB38, GSPT1, PDCD1, FYN, TIGIT, SRSF7 and TNFRSF4, whereas regions in IFNG, TBX21, SLAMF7, SLAMF8, FASLG, NDIFP2, MAPK1, ITPR1, VDAC1P2 and LAG3 were identified for Th1 cells, respectively. Pyrosequencing assays were utilized for further validation. Methylome analyses on ncTh1 cells confirmed a shared Th1- and Th17-specific epigenetic phenotype with novel uniquely demethylated regions identified in RUNX2, RPTOR and SLC38A9 gene loci. Functional characterization of the novel identified DMRs was assessed by utilizing a CpG-free reporter system. Luciferase assays in primary human CD4+ T cells revealed that promoter-located DMRs in GSPT1, SRSF7, SLAMF7, SLAMF8, TIGIT and PDCD1 were modulated in a methylation-dependent fashion. Further expression studies (RNA-seqL) using ex vivo isolated human T naive, Th1 and Th17 helper cells, revealed a distinct anti-correlation between methylation and gene expression in a subset-specific manner, displayed by many genes from the identified epigenetic signatures. In order to delineate the transcription factor network involved in the observed epigenetic regulation, in silico TF overrepresentation analyses (TFBS) were refined with expression data and revealed a common TF network which can be modulated by subset-specific TFs like EOMES for Th1 and RORγt for Th17 cells. Finally, SLAMF7 was identified to be uniquely demethylated and overexpressed in Th1 cells, both on RNA and protein levels. Overall, we revealed for the first time the whole-genome methylome of specific Th subsets which was previously neglected. Impact of DNA methylation on identified DMRs’ activity was demonstrated and implicated TF modules were unraveled, whilst SLAMF7 was newly shown to be under epigenetic control in Th1 cells. Altogether, our findings could shed new light on Th cell differentiation processes approached from a new layer which could inspire the development of novel immune therapies.

Οι κληρονομήσιμες επιγενετικές τροποποιήσεις παίζουν ουσιαστικό ρόλο στις διαδικασίες διαφοροποίησης των CD4+ T βοηθητικών κυττάρων (Th). Στην παρούσα διατριβή, ξετυλίγεται το μεθυλίωμα των ανθρώπινων αδιαφοροποίητων Τ, Τ βοηθητικών τύπου 1 (Th1), Τ βοηθητικών τύπου 17 (Th17) και μη κλασικών Τ βοηθητικών τύπου 1 (ncTh1) κυττάρων, πραγματοποιώντας αναλύσεις στο μεθυλίωμα όλου του γονιδιώματος τους (WGBS). Πραγματοποιήθηκε επιγενετικός χαρακτηρισμός κάθε υποομάδας κυττάρων και αποκαλύφθηκαν διαφορικά μεθυλιωμένες περιοχές (DMRs) που παίζουν τον ρόλο ειδικών υπογραφών για τον εκάστοτε κυτταρικό τύπο. Μοναδικά απομεθυλιωμένες περιοχές σε Τ βοηθητικά κύτταρα τύπου 17 ανιχνεύθηκαν σε γονίδια όπως τα IL-17A, RORC, HNRNPLL, ZBTB38, GSPT1, PDCD1, FYN, TIGIT, SRSF7 και TNFRSF4, ενώ μοναδικές απομεθυλιώσεις σε περιοχές γονιδίων όπως τα IFNG, TBX21, SLAMF7, SLAMF8, FASLG, NDIFP2, MAPK1, ITPR1, VDAC1P2 και LAG3 ταυτοποιήθηκαν για τα Τ βοηθητικά κύτταρα τύπου 1, αντίστοιχα. Περαιτέρω επιβεβαίωση των ευρημάτων επιτεύχθηκε με την πραγματοποίηση δοκιμών πυροαλληλουχίας (pyrosequencing). Οι αναλύσεις του μεθυλιώματος μη κλασικών Τ βοηθητικών κυττάρων τύπου 1 (ncTh1) επιβεβαίωσαν έναν κοινό με τα Th1- και Th17 βοηθητικά κύτταρα φαινότυπο, με νέες μοναδικά απομεθυλιωμένες περιοχές που ανακαλύφθηκαν σε γονιδιακές περιοχές των RUNX2, RPTOR και SLC38A9. Ο λειτουργικός χαρακτηρισμός των νέων μοναδικά απομεθυλιωμένων περιοχών (DMR) πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια ενός πλασμιδιακού φορέα ελεύθερου από CpG περιοχές οι οποίες μόνο μπορούν να υποστούν μεθυλίωση. Δοκιμασίες λουσιφεράσης σε πρωτογενή ανθρώπινα CD4+ Τ κύτταρα με τον ανωτέρω πλασμιδιακό φορέα κατόπιν τροποποίησης του, αποκάλυψαν ότι μοναδικά απομεθυλιωμένες περιοχές που εντοπίζονται σε υποκινητές γονιδίων όπως GSPT1, SRSF7, SLAMF7, SLAMF8, TIGIT και PDCD1 μπορούν να ρυθμιστούν με τρόπο που εξαρτάται από τη μεθυλίωση τους. Περαιτέρω μελέτες γονιδιακής έκφρασης (RNA-seqL) χρησιμοποιώντας ex vivo απομονωμένα ανθρώπινα αδιαφοροποιήτα Τ, Th1 και Th17 βοηθητικά κύτταρα, αποκάλυψαν μια μοναδική συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης και γονιδιακής έκφρασης σε συγκεκριμένα γονίδια που ανήκουν στις επιγενετικές υπογραφές που ανακαλύφθηκαν και είναι ξεχωριστές για κάθε κυτταρικό τύπο. Προκειμένου να αποκαλυφθεί το δίκτυο μεταγραφικών παραγόντων που είναι υπεύθυνο για την επιγενετική ρύθμιση των περιοχών αυτών, πραγματοποιήθηκαν in silico αναλύσεις πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων (TFBS). Οι αναλύσεις αυτές, βελτιώθηκαν περεταίρω χρησιμοποιώντας τα δεδομένα έκφρασης μεταγραφικών παραγόντων από τις μελέτες γονιδιακής έκφρασης σε κάθε τύπο κυττάρου. Με αυτόν τον τρόπο αποκαλύφθηκε ένα κοινό ρυθμιστικό δίκτυο μεταγραφικών παραγόντων που μπορεί να ρυθμιστεί από παράγοντες που είναι μοναδικοί σε συγκεκριμένους κυτταρικούς υπότυπους όπως ο EOMES για τα Th1 και ο RORγt για τα Th17 κύτταρα. Τέλος, το γονίδιο SLAMF7 ανακαλύφθηκε ότι είναι μοναδικά απομεθυλιωμένο και ταυτόχρονα υπερεκφράζεται στα Th1 κύτταρα, τόσο σε επίπεδα RNA όσο και σε πρωτεϊνικά επίπεδα. Συνολικά, στην παρούσα διατριβή αποκαλύφθηκε για πρώτη φορά το μεθυλίωμα ολόκληρου του γονιδιώματος συγκεκριμένων υποτύπων Τ βοηθητικών κυττάρων, το οποίο τα προηγούμενα χρόνια είχε εντελώς παραμεληθεί. Αποδείχθηκε η επίδραση της μεθυλίωσης του DNA στις νεοανακαλυφθέντες μοναδικά απομεθυλιωμένες περιοχές, καθώς επίσης αποκαλύφθηκε και το δίκτυο των εμπλεκόμενων μεταγραφικών παραγόντων που είναι υπεύθυνοι για τη λειτουργία των περιοχών αυτών. Ταυτόχρονα, το γονίδιο SLAMF7 αποδείχθηκε για πρώτη φορά ότι βρίσκεται υπο επιγενετική ρύθμιση στα Τ κύτταρα βοηθητικού τύπου 1. Συνοψίζοντας, τα ευρήματά μας μπορούν να ρίξουν νέο φως στις διαδικασίες διαφοροποίησης των Τ βοηθητικών κυττάρων, προσεγγίζοντας τες από μια νέα οπτική που θα μπορούσε να εμπνεύσουν την ανάπτυξη νέων ανοσοθεραπειών.

Erbliche epigenetische Modifikationen spielen eine wesentliche Rolle in T ZellDifferenzierungsprozessen. In der vorliegenden Studie, haben wir das Methylom von humanen naiven, Th1-, Th17- und ‚non-classic‘ Th1 Zellen identifiziert, indem wir eine Bisulfitsequenzierungsanalyse (WGBS) durchgeführt haben. Jede Untergruppe wurde epigenetisch charakterisiert und differentiell methylierte Regionen (DMRs) wurden als T Zell-spezifische epigenetische Signaturen identifiziert. Eindeutig demethylierte Regionen in Th17 Zellen wurden in Genen wie IL-17A, RORC, HNRNPLL, ZBTB38, GSPT1, PDCD1, FYN, TIGIT, SRSF7 und TNFRSF4 nachgewiesen. Für Th1 Zellen wurden hingegen Regionen in IFNG, TBX21, SLAMF8, FASLG, NDFIP2, ITPR1, VDAC1P2 und LAG3 identifiziert. Pyrosequenzierungsassays wurden zur weiteren Validierung verwendet. MethylomAnalysen an ‚non classic‘ Th1 Zellen bestätigten einen gemeinsamen epigenetischen Th1- und Th17 Phänotyp mit neuartigen, demethylierten Regionen, die in RUNX2, RPTOR und SLC38A9 Genorten identifiziert wurden. Die funktionelle Charakterisierung der neu identifizierten DMRs wurde unter Verwendung eines CpG-freien Reportersystems bewertet. Luciferase-Assays in primären humanen CD4+ T Zellen zeigten, dass Promotor-lokalisierte DMRs in GSPT1, SRSF7, SLAMF7, SLAMF8, TIGIT und PDCD1 methylierungsabhängig moduliert wurden. Weitere Expressionsstudien (RNA-seqL ) unter Verwendung von ex vivo isolierten humanen T naiven, Th1- und Th17 Zellen, zeigten eine deutliche Korrelation zwischen Methylierung und Genexpression in einer Untergruppenspezifischen Weise. Diese wurde von vielen Genen aus den identifizierten epigenetischen Signaturen gezeigt. Um das an der beobachteten epigenetischen Regulation beteiligte Transkriptionsfaktoren (TF) Netzwerk abzugrenzen, wurden in silico TF-Überrepräsentationsanalysen mit Expressionsdaten verfeinert und ein gemeinsames TF-Netzwerk gefunden. Dieses kam durch Untergruppen-spezifische TFs wie EOMES für Th1 und RORγt für Th17 Zellen moduliert werden kann. Schließlich, wurde SLAMF7 als eindeutig demethyliert und in Th1 Zellen sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene identifiziert. Zusammenfassend, haben wir zum ersten Mal das bisher vernachlässigte Methylierungsmuster auf Genomebene einzelner T Zellen enthüllt. Der Einfluss der DNA-Methylierung auf die Aktivität der identifizierten DMRs wurde demonstriert und implizierte TF-Module wurden entschlüsselt. Wir konnten zeigen, dass SLAMF7 in Th1 Zellen unter epigenetischer Kontrolle steht. Insgesamt, werfen unsere Ergebnisse ein neues Licht auf die Th- Zelldifferenzierungsprozesse und diese Entwicklungen könnten neue Immuntherapien inspirieren.