Modeling and optimization of 3D stem cells bioprocesses

Abstract

Clinical need for bone implants has been steadily increasing in the last few decades. The rising demand is partially attributed to the rise in living standards across the world and a corresponding increase in the percentage of elderly people (who are more susceptible to injury) in the general population.Together with the rising demand, newer medical procedures that are more effective and are associated with fewer risks (such as donor site morbidity) have been developed. Both in the past, and to continue the useful trend into the future, cells suitable for implantation in critical sized bone defects can be produced by the in vitro expansion and osteogenic differentiation of stem cells.To help make such experimental processes more efficient — both in terms of cost, as well as the quality of the product (bone cell implant) — mathematical models can accelerate the model based optimization of the experimental techniques used for producing the implants, and the cells contained within the implants themselves.Towards this end, this PhD thesis introduces two mathematical models for the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in vitro. The first model addresses osteogenic differentiation in well plate cultures and is constructed around a population balance core that enables it to capture and deconvolute cell cycle heterogeneity; it also incorporates the activity of key intracellular metabolic pathways (i.e., glycolysis and tricarboxylic acid cycle) and representative osteogenic genes (Runx2 and osteonectin). The mathematical model is built from first principles and obeys mass conservation laws. The key finding based on simulation results implies the existence of a tradeoff between proliferation and differentiation, predicting a delay in the onset of differentiation when cells are allowed to cycle faster. The simulations leading to this conclusion did not model energy competition and suggest that the tradeoff is intrinsic, beyond the constraints imposed by the limited availability of energy molecules within cells.The mathematical model is then extended to a rotating wall bioreactor, whereby cells (cultured in a three dimensional environment) are encapsulated in alginate gelatin beads, introducing a multiscale description of the osteogenic differentiation process: from the cellular size scale, through the alginate gelatin bead scale, to the bioreactor size scale. The mathematical model incorporates the same metabolic pathways and key genes, additionally capturing spatial heterogeneity within the beads. The discretized formulation of the model consists of 12,563 simultaneous ordinary differential equations. Predicted metabolic changes and gene activation (Runx2 and osteonectin) in alginate gelatin-bead-encapsulated cells are slightly delayed compared with well-plate cultures, result attributed to mass transfer limitations within the hydrogel bead.Global sensitivity analysis revealed that parameters related to gene expression (decay rates and gene transcription activation constants) carry the most significance and should be the focus of future parameter estimation efforts. Hydrogel bead size does not meaningfully impact simulation outcomes for beads smaller than 4 mm in diameter. An analysis of the mathematical model renders the outcome of the simulations qualitatively correct, within the limitations imposed by the reduced subset of metabolites and genes included in the model.The mathematical models introduced by the research showcased in this thesis can function as a framework for future model based bioreactor and bioprocess optimization. Due to the large size of the mathematical model in terms of number of equations, the multiscale model requires the use of high performance computing systems to reduce the currently prohibitive time required to solve optimization problems on a single computer.

Η κλινική ανάγκη για οστικά εμφυτεύματα αυξάνεται σταθερά τις τελευταίες δεκαετίες. Η αυξανόμενη αυτή ζήτηση αποδίδεται εν μέρει στην άνοδο του βιοτικού επιπέδου παγκοσμίως και στην σημαντική αύξηση του ποσοστού των ηλικιωμένων (που είναι πιο επιρρεπείς σε τραυματισμούς) στον γενικό πληθυσμό.Παράλληλα με την αυξανόμενη ζήτηση, έχουν αναπτυχθεί νεότερες ιατρικές τεχνικές που είναι πιο αποτελεσματικές και συνδέονται με λιγότερους κινδύνους (όπως η νοσηρότητα του δότη). Τόσο στο παρελθόν, όσο και για να συνεχιστεί η χρήσιμη τάση στο μέλλον, κύτταρα κρίσιμου μεγέθους, κατάλληλα για εμφύτευση σε οστικά ελαττώματα, μπορούν να παραχθούν με την in vitro ανάπτυξη και την οστεογονική διαφοροποίηση των βλαστοκυττάρων.Για να γίνουν πιο αποτελεσματικές τέτοιες πειραματικές διεργασίες — τόσο από άποψη κόστους όσο και από άποψη ποιότητας του τελικού προϊόντος (εμφύτευμα οστικών κυττάρων) — μαθηματικά μοντέλα μπορούν να επιταχύνουν τη βελτιστοποίηση (βάσει μοντέλου) των πειραματικών τεχνικών που χρησιμοποιούνται τόσο για την παραγωγή των εμφυτευμάτων όσο και την ανάπτυξη των κυττάρων που περιέχονται στα ίδια τα εμφυτεύματα.Η παρούσα διατριβή προτείνει αρχικά ένα μαθηματικό μοντέλο για την οστεογονική διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών βλαστοκυττάρων in vitro. Τα μοντέλα έχουν αναπτυχθεί γύρω από ένα πληθυσμιακό ισοζύγιο που επιτρέπει την λεπτομερή μοντελοποίηση της εγγενούς ετερογένειας του κυτταρικού κύκλου, ενσωματώνοντας τη δραστηριότητα βασικών ενδοκυτταρικών μεταβολικών οδών (κύκλος γλυκόλυσης και τρικαρβοξυλικού οξέος) και αντιπροσωπευτικά οστεογονικά γονίδια. Το μοντέλο βασίζεται σε θεμελιώδεις αρχές και ισχύοντες νόμους διατήρησης. Τα αποτελέσματα της προσομοίωσης των μοντέλων αποδεικνύουν την ύπαρξη αντιστάθμισης μεταξύ του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των κυττάρων, προβλέποντας μια καθυστέρηση στην έναρξη της διαφοροποίησης όταν τα κύτταρα αφήνονται να ανακυκλωθούν ταχύτερα.Το αρχικό μαθηματικό μοντέλο επεκτείνεται στη συνέχεια σε έναν βιοαντιδραστήρα περιστρεφόμενου τοιχώματος, όπου τα κύτταρα ενθυλακώνονται σε σφαιρίδια αλγινικής ζελατίνης, εισάγοντας έτσι την δυνατότητα περιγραφής πολλαπλών κλιμάκων της διαδικασίας διαφοροποίησης: από την κλίμακα κυτταρικού μεγέθους, μέσω της κλίμακας σφαιριδίων αλγινικής ζελατίνης και τέλος στην κλίμακα μεγέθους του βιοαντιδραστήρα. Το μαθηματικό μοντέλο ενσωματώνει τις ίδιες μεταβολικές οδούς και βασικά γονίδια, καταγράφοντας επιπλέον τη χωρική ετερογένεια μέσα στα σφαιρίδια. Το διακριτοποιημένο μοντέλου αποτελείται από 12.563 συνήθεις διαφορικές εξισώσεις. Οι συγκεντρώσεις βασικών μεταβολιτών (π.χ. γλυκόζη, πυροσταφυλικό, γλουταμίνη, γαλακτικό) συγκρίνονται με πειραματικά δεδομένα από καλλιέργειες στατικών πλακών φρεατίων, αποδεικνύοντας ότι οι προβλέψεις του μοντέλου είναι ικανοποιητικές. Φαίνεται επίσης ότι η γονιδιακή ενεργοποίηση (Runx2 και οστεονεκτίνη) σε κύτταρα ενθυλακωμένα με σφαιρίδια αλγινικής ζελατίνης καθυστερεί ελαφρώς σε σύγκριση με καλλιέργειες σε πλακίδια . Μια ολική ανάλυση ευαισθησίας αποκαλύπτει ότι οι παράμετροι που σχετίζονται με την έκφραση των γονιδίων (ρυθμοί διάσπασης και σταθερές ενεργοποίησης μεταγραφής γονιδίων) έχουν τη μεγαλύτερη βαρύτητα και θα πρέπει να αποτελούν το επίκεντρο της μελλοντικής εκτίμησης παραμέτρων. Το μέγεθος των σφαιριδίων υδρογέλης δεν επηρεάζει σημαντικά τα αποτελέσματα της προσομοίωσης για διαμέτρους σφαιριδίων στην περιοχή 2–3 mm.Τα μαθηματικά μοντέλα που παρουσιάζονται σε αυτή τη διατριβή μπορούν να εξασφαλίσουν ένα υπολογιστικό πλαίσιο για την μελλοντική βελτιστοποίηση βιοαντιδραστήρων και βιοδιαδικασιών βάσει μοντέλων. Λόγω του μεγάλου μεγέθους τους, τα προτεινόμενα μοντέλα πολλαπλής κλίμακας απαιτούν τη χρήση υπολογιστικών συστημάτων υψηλής απόδοσης για τη μείωση του επί του παρόντος υψηλού υπολογιστικού χρόνου που απαιτείται για την επίλυση τέτοιων προβλημάτων βελτιστοποίησης σε έναν μόνο υπολογιστή.