Characterization of insecticide resistance mechanisms of the olive fly (Bactrocera oleae) and its interactions with symbiotic bacteria of the species Candidatus Erwinia dacicola

Abstract

The olive fruit fly Bactrocera oleae (B. oleae) is considered the major insect pest in olive orchards, causing great damage in the quality and the quantity of the olive production worldwide. However, its pest management approaches have proven difficult and inefficient, for a variety of reasons, a fact that has brought about a need for alternative tools and approaches. The objective of this thesis is to provide new insights and characterize mechanisms, potentially implicated in insecticide resistance, one of the limiting factors for an efficient pest management, as well as in the interactions between the olive fly and its symbiotic bacteria, especially of the species Candidatus Erwinia dacicola (Ca. E. dacicola), towards the establishment of innovative olive fly control strategies, which will target the symbiotic relationship with the bacterial partners (dysbiosis).The present study is divided in 3 sections. In the first, the aim was to develop and apply a highly precise genome editing tool for Bactrocera oleae, and particularly, a CRISPR/Cas9 technology- based approach. We chose to target the scarlet gene in B. oleae, which provides an easy to screen eye color phenotype, in order to demonstrate that this technology is applicable to this non- model organism. We report the development of a CRISPR/Cas9 gene editing tool, using the well- known eye color marker gene scarlet. Two synthetic guide RNAs targeting the coding region of the scarlet gene were synthesized and shown to work efficiently in vitro. These sgRNAs along with purified Cas9 protein were then micro-injected into early-stage embryos. Successful CRISPR- induced mutations of both copies of the scarlet gene showed a striking yellow eye phenotype, indicative of gene disruption. Multiple successful CRISPR events were confirmed by PCR and sequencing. The establishment of an efficient CRISPR/Cas9-based gene editing tool in B. oleae will enable the study of critical molecular pathways in olive fly biology and physiology. The availability of such a genetic tool will enable a better understanding concerning the potent roles of various genes and mechanisms (i.e. critical symbiosis-based interactions with bacterial partners, insecticide resistance), towards the future development and application of novel pest control strategies.In the second section of this thesis, we investigated potential mechanisms which are implicated in insecticide resistance of B. oleae. Olive fly pest management in Greece has relied mostly on the use of chemical (small-molecule) insecticides. The long overuse of organophosphorus-based (OP) insecticides has resulted in the development of resistance to this compound. OPs target the acetylcholinesterase enzyme (AChE) and suppress its function, which is the hydrolysis of the neurotransmitter acetylcholine (ACh), in order to prevent neuro-toxicity and subsequent death of the insect. In the first part of this second section, we attempted the functional validation of a target site mutation in the AChE of B. oleae, namely Δ3Q, which has been associated with OP resistance in B. oleae, after field screens and in vitro experiments, since 2008. The deletion of these three amino acids in its last exon, has been proposed to provide a better anchoring of the enzyme on the cell membrane, and as a result, the available molecules that hydrolyze ACh and interact with the insecticide are increased, resulting in survival of the olive fly at higher doses of insecticide, conferring resistance to OP compounds. However, this hypothesis has not been supported with in vivo evidence yet. The aim of this study was to investigate this hypothesis in vivo, and more specifically by introducing the Δ3Q mutation, with the CRISPR/Cas9 gene editing tool developed in the previous section, in a susceptible genetic background of a laboratory-reared B. oleae strain and study the mutant phenotype upon insecticide application.A strategy was implemented in which purified and commercially available Cas9 protein along with multiple sgRNAs and a synthetic donor ssODN DNA template (IDT) were introduced into early embryos with microinjections, following the protocol that was established in the previous section, in order to knock-in the Δ3Q modification, by homologous recombination (HDR mechanism). The results showed that although in vitro, five out of the total seven sgRNAs direct the Cas9 to the desired sites, in order to cleave the DNA and potently integrate the donor template (including the Δ3Q instead of the WT 5Q in the end of AChE), the corresponding result was not accomplished in vivo;; approximately 2,174 olive fly embryos were injected and sequenced in groups. Sequencing results did not show any DNA cleavage, suggesting an insufficient Cas9 RNP uptake by the oocytes, resulting in a micro-injection protocol with very low efficiency. We conclude that the knock-in method requires further improvements, in order to successfully introduce mutations and study them functionally with the CRISPR/Cas9 genome modification tool.In the second part of the second section of this thesis, we searched for potent gene candidates, implicated in pyrethroid resistance of olive flies, using transcriptome sequencing on olive fly malpighian tubules (MTs). The aim of this study was to identify genes not immediately apparent in the already existing whole organism RNA sequencing data, through a gene expression comparison in MTs, one of the proposed detoxification tissues in insects, dissected out of pyrethroid resistant and susceptible olive flies. Sequencing of the extracted RNA was performed using the Illumina platform, in three biological replicates for each one of the two populations. Sequencing reads were then aligned back to the olive fly genome reference sequence, gene expression levels were calculated and the up- and down-regulated genes, both in resistant and susceptible samples were identified. As expected, many genes that are well known to be implicated in insecticide resistance were identified, such as cytochrome P450s (CYPs), glutathione S-transferases (GSTs) and UDP-glucuronosyltransferases (UGTs). Moreover, several other genes were also identified, but their role in insecticide resistance remains to be elucidated via further investigation.The over-expression of two P450 genes (CYP4P6 and CYP6G28) that were highlighted in the RNAseq data, was quantitatively validated with qPCR analysis and the functional validation of one of them, through gene silencing upon dsRNA injections (using the RNA interference technology, RNAi), revealed a promising phenotype, upon insecticide treatment;; specifically, a 30% down-regulation of the CYP4P6 gene (compared to the control levels of the gene) conferred a 21% mortality to the injected olive flies, upon α-cypermethrin application, compared to the control group (4%). However, despite the promising phenotype conferred upon silencing of the CYP4P6 gene, foreshadowing a possible implication of this gene in pyrethroid resistance, the season-dependent limitation factor of this pest species did not allow the export of a complete and statistically significant conclusion, within the framework of this PhD thesis.A general enrichment in the transcription of several genes from the five major detoxification gene families was observed in the MT-specific RNA dataset of resistant olive flies, providing new insights for the detoxification of insecticides in this species. However, further functional characterization studies are required. Following the encouraging preliminary results reported in the current study (concerning the role of the CYP4P6 gene), which require further validation steps, the interesting gene cases can be further investigated with in vitro insecticide metabolism assays, in order to confirm a potent implication in the detoxification procedures of insecticides. Therefore, such knowledge may contribute in the development of effective strategies for controlling this destructive pest and protecting the olive trees, the cultivation of which is of great regional importance, based on improved molecular diagnostics tools.Moreover, in the third section of this thesis, we discuss the unique ability of olive flies to utilize unripe olives for their development, which has been associated with interactions with symbiotic bacteria. In this chapter, the aim was to investigate and define critical aspects of the unique symbiotic relationship, between the olive fly host and the Ca. E. dacicola bacterial symbiont. The objective of the current approach was to acquire further information for this unique symbiosis, through microscopy and transcriptomics analysis. At first, the determination of the relative abundance of Ca. E. dacicola during the life cycle of the olive fly, from the larval to the adult stage, comparing flies developing in unripe and ripe olives, was performed using real time quantitative PCR (RT-qPCR) and the data revealed that the bacterial titer is fluctuating between different developmental stages. Furthermore, we report, through confocal scanning imaging techniques, the localization of the bacterial symbionts in a specific part of the olive fly midgut, namely the gastric caeca, during the larval stages of the host. Noticeably, gastric caeca transform morphologically, depending on the developmental stage of the larva. Afterwards, a pairwise comparison was set, in order to define critical aspects, concerning the transformation of the gastric caeca during development, at a gene level. Gastric caeca which were dissected out of second and third instar larvae, revealed many genes potentially involved in the olive fly development. Moreover, comparative analysis between gastric caeca from second instar larvae developing in olives as well as in artificial diet, identified genes of the host, which are potentially involved in the establishment and the regulation of this symbiosis, since wild-type animals contain huge numbers of the symbiont partner, while the laboratory-reared do not. Subsequently, significant changes in transcript expression levels were reported and a detailed analysis of the data was undertaken, focusing on certain groups of genes that potentially participate in the symbiosis, as well as in the developmental transformation of the gastric caeca.The new insights that are reported in this study, concerning the olive fly development and its interaction with this vertically transmitted and obligate symbiont partner, Ca. E. dacicola, can be exploited for the future development of symbiosis-based pest management strategies, concerning the olive fly control. Particularly, a better understanding of this symbiotic relationship will serve as the basis for the future development of novel olive fly control approaches, targeting this or other bacterial partners, by using molecular and classical tools in smart applications. Taken together, the data that are provided through this work, namely the establishment of a precise genome editing tool for B. oleae (CRISPR/Cas9) and the resistance-specific and symbiosis-specific released gene datasets, generate the opportunity to address the molecular basis of insecticideresistance and symbiosis with bacterial partners mechanisms of the olive flies, in a systemic manner and, moreover, utilize the acquired knowledge towards the development of innovative pest control strategies, which will go beyond the traditional approaches and that will efficiently control this destructive pest species.

O δάκος της ελιάς, Bactrocera oleae (B. oleae) αποτελεί τον πιο σημαντικό εχθρό της ελαιοκαλλιέργειας, προκαλώντας έντονη υποβάθμιση τόσο στην ποιότητα όσο και στην ποσότητα της ελαιοπαραγωγής παγκοσμίως. Ωστόσο, οι διαφορετικές στρατηγικές διαχείρισης του εντόμου έχουν αποδειχθεί δύσκολες και αναποτελεσματικές για διάφορους λόγους, γεγονός το οποίο έχει δημιουργήσει την ανάγκη για ανάπτυξη εναλλακτικών εργαλείων και προσεγγίσεων. Στόχος αυτής της διατριβής είναι να παράσχει νέες γνώσεις και να χαρακτηρίσει μηχανισμούς οι οποίοι πιθανώς να εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα του δάκου στα εντομοκτόνα, έναν από τους βασικότερους περιοριστικούς παράγοντες όσον αφορά την αποτελεσματική διαχείριση των εντόμων, καθώς και στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ του δάκου και των συμβιωτικών βακτηρίων του είδους Candidatus Erwinia dacicola (Ca. E. dacicola), αποβλέποντας στην ανάπτυξη μιας νέας γενιά καινοτόμων στρατηγικών ελέγχου του εντόμου, οι οποίες θα στοχεύουν στη διατάραξη της συμβιωτικής του σχέσης με τα βακτήρια (dysbiosis).Η παρούσα μελέτη χωρίζεται σε 3 ενότητες. Στην πρώτη ενότητα, ο στόχος ήταν να αναπτυχθεί και να εφαρμοστεί ένα ακριβές εργαλείο τροποποίησης του γονιδιώματος στο δάκο, και συγκεκριμένα μια προσέγγιση βασισμένη στην τεχνολογία CRISPR/Cas9. Επιλέξαμε να στοχεύσουμε το γονίδιο scarlet, το οποίο προσφέρει έναν εύκολα ανιχνεύσιμο φαινότυπο στο χρώμα των ματιών του εντόμου, προκειμένου να αποδείξουμε ότι αυτή η τεχνολογία είναι εφαρμόσιμη σε αυτόν τον οργανισμό. Δύο sgRNA μόρια-οδηγοί μαζί με την ενδονουκλεάση Cas9 ενέθηκαν σε έμβρυα δάκου αρχικού σταδίου. Οι γονιδιακές τροποποιήσεις στο γονίδιο scarlet, οι οποίες δημιούργησαν έναν εντυπωσιακό φαινότυπο κίτρινων ματιών, επιβεβαιώθηκαν με PCR και αλληλούχηση. Η δημιουργία ενός αποτελεσματικού εργαλείου τροποποίησης γονιδίων, με χρήση της τεχνολογίας CRISPR/Cas9 για το δάκο της ελιάς, θα διευκολύνει τη μελέτη κρίσιμων μοριακών μονοπατιών στη βιολογία και τη φυσιολογία του εντόμου. Η διαθεσιμότητα ενός τέτοιου μοριακού εργαλείου θα επιτρέψει την καλύτερη κατανόηση των ρόλων διαφόρων γονιδίων και μηχανισμών (ανθεκτικότητα σε εντομοκτόνα, αλληλεπιδράσεις με συμβιωτικά βακτήρια κ.α.), με σκοπό τη μελλοντική ανάπτυξη και εφαρμογή νέων στρατηγικών διαχείρισης του δάκου.Στη δεύτερη ενότητα αυτής της μελέτης, διερευνήσαμε μηχανισμούς που πιθανώς εμπλέκονται στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας του δάκου σε διαφορετικά εντομοκτόνα. Η διαχείριση του δάκου της ελιάς στην Ελλάδα έχει βασιστεί κυρίως στη χρήση χημικών (μικρομοριακών) εντομοκτόνων. Η μακροχρόνια υπερβολική χρήση οργανοφωσφορικών εντομοκτόνων (OP) έχει δημιουργήσει σοβαρά προβλήματα ανάπτυξης ανθεκτικότητας σε αυτές τις χημικές ενώσεις. Τα OP στοχεύουν το ένζυμο ακετυλοχολινεστεράση (AChE) του εντόμου και καταστέλλουν τη λειτουργία του, η οποία είναι η υδρόλυση του νευροδιαβιβαστή ακετυλοχολίνη (ACh), με αποτέλεσμα να προκαλείται νευροτοξικότητα και επακόλουθος θάνατος του εντόμου. Στο πρώτο μέρος της δεύτερης ενότητας, επιχειρήσαμε το λειτουργικό χαρακτηρισμό μιας μεταλλαγής στόχου στην AChE του δάκου (απαλοιφή τριών γλουταμινών, Δ3Q), η οποία έχει συσχετιστεί με την ανθεκτικότητα του δάκου στα OP από το 2008, μέσα από πειράματα πεδίου και in vitro δοκιμές. Έχει προταθεί ότι η απαλοιφή αυτών των τριών αμινοξέων στο τελευταίο εξόνιο του γονιδίου, παρέχει καλύτερη αγκυροβόληση της πρόδρομης μορφής του ενζύμου στην κυτταρική μεμβράνη.Το αποτέλεσμα είναι να αυξάνονται τα διαθέσιμα μόρια που υδρολύουν την ACh και αλληλεπιδρούν με το εντομοκτόνο. Με αυτόν τον τρόπο, ο δάκος επιβιώνει σε υψηλότερες δόσεις του εντομοκτόνου, αναπτύσσοντας ανθεκτικότητα σε αυτές τις ενώσεις. Ωστόσο, αυτή η υπόθεση δεν έχει υποστηριχθεί ακόμη με in vivo δεδομένα. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί αυτή η υπόθεση in vivo, και πιο συγκεκριμένα με την εισαγωγή της μετάλλαξης Δ3Q, με το εργαλείο γονιδιακής τροποποίησης CRISPR/Cas9 το οποίο αναπτύχθηκε στην προηγούμενη ενότητα, σε ένα ευαίσθητο γενετικό υπόβαθρο ενός εργαστηριακού στελέχους δάκου, με στόχο την μελέτη του φαινοτύπου κατά την εφαρμογή OP εντομοκτόνου.Εφαρμόστηκε λοιπόν μια στρατηγική κατά την οποία η καθαρισμένη και εμπορικά διαθέσιμη πρωτεΐνη Cas9 μαζί με sgRNA μόρια οδηγούς και ένα συνθετικό DNA δότη ssODN ενέθηκαν σε έμβρυα δάκου, σύμφωνα με τη μεθοδολογία η οποία αναπτύχθηκε στην προηγούμενη ενότητα, με σκοπό την ενσωμάτωση της μεταλλαγής Δ3Q, με ομόλογο ανασυνδυασμό (μηχανισμός HDR). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αν και in vitro, πέντε από τα συνολικά επτά sgRNAs κατευθύνουν την Cas9 στις επιθυμητές θέσεις κοπής, προκειμένου να κατατμηθεί το DNA και δυνητικά να ενσωματωθεί το πρότυπο κομμάτι DNA (το οποίο περιλαμβάνει τη μεταλλαγή Δ3Q στο τέλος της AChE), το αντίστοιχο αποτέλεσμα δεν επιτεύχθηκε in vivo. 2,174 έμβρυα δάκου ενέθηκαν και αλληλουχήθηκαν σε ομάδες. Τα αποτελέσματα δεν έδειξαν κάποια κατάτμηση του DNA, υποδηλώνοντας την πιθανώς ανεπαρκή πρόσληψη του συμπλόκου Cas9/RNP από τα πολικά ή τα ωοθυλακικά κύτταρα του εμβρύου, γεγονός που υποδεικνύει τη χαμηλή απόδοση αυτής της μεθοδολογίας μικρο-ενέσεων σε αυτό το έντομο. Συμπερασματικά, η knock-in μέθοδος με χρήση του εργαλείου γονιδιωματικής τροποποίησης CRISPR/Cas9 χρήζει περαιτέρω βελτίωσης, προκειμένου να εισάγονται επιτυχώς μεταλλάξεις για το λειτουργικό χαρακτηρισμό γονιδίων και μηχανισμών.Στο δεύτερο μέρος της δεύτερης ενότητας της διατριβής, ψάξαμε για υποψήφια γονίδια στο δάκο, τα οποία συμμετέχουν σε μηχανισμούς ανθεκτικότητας σε πυρεθροειδή εντομοκτόνα, μέσω RNA αλληλούχησης, ειδικά στα μαλπιγγιανα σωληνάρια (malpighian tubules, MTs) του εντόμου. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να ταυτοποιηθούν γονίδια τα οποία έχουν ιστο-ειδική έκφραση και ως εκ τούτου δεν θα ήταν εύκολο να ανιχνευτούν σε δεδομένα RNA αλληλούχησης ολόκληρου του οργανισμού. Η μελέτη αυτή επιτεύχθηκε μέσω σύγκρισης της γονιδιακής έκφρασης στα MTs, έναν από τους προτεινόμενους ιστούς αποτοξικοποίησης στα έντομα, σε έναν ανθεκτικό και έναν ευαίσθητο σε πυρεθροειδή πληθυσμό. Η αλληλούχηση του RNA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα Illumina, σε τρεις βιολογικές επαναλήψεις για κάθε έναν από τους δύο πληθυσμούς. Στη συνέχεια, οι αλληλουχίες RNA στοιχήθηκαν με τη διαθέσιμη αλληλουχία αναφοράς του γονιδιώματος του δάκου της ελιάς, υπολογίστηκαν τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης και ταυτοποιήθηκαν γονίδια τα οποία σημείωσαν υπερ-έκφραση ή υπο- έκφραση, τόσο στον ανθεκτικό όσο και στον ευαίσθητο πληθυσμό. Όπως ήταν αναμενόμενο, εντοπίστηκαν πολλά γονίδια τα οποία είναι ευρέως γνωστό ότι εμπλέκονται σε μηχανισμούς ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα, όπως οι P450 μονοοξυγενάσες (cytochrome P450s), οι S- τρανσφεράσες της γλουταθειόνης (GSTs) και οι UDP-γλυκουρονοσυλο-τρανσφεράσες (UGTs). Επιπλέον, εντοπίστηκαν πολλά άλλα γονίδια, των οποίων ο πιθανός ρόλος τους σε μηχανισμούς ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα μένει να αποσαφηνιστεί μέσω περαιτέρω έρευνας.Η υπερ-έκφραση δύο γονιδίων μονοοξυγενασών P450 (CYP4P6 και CYP6G28) η οποία επισημάνθηκε στα δεδομένα RNA, επικυρώθηκε ποσοτικά με ανάλυση RT-qPCR και ο λειτουργικός χαρακτηρισμός ενός από αυτά, μέσω γονιδιακής σίγασης (με τη χρήση της τεχνολογίας παρεμβολής RNA, RNAi), απέδωσε έναν πολλά υποσχόμενο φαινότυπο, μετά από εφαρμογή βιοδοκιμής τοξικότητας με alpha-cypermethrin (πυρεθροειδές εντομοκτόνο). Συγκεκριμένα, η μειωμένη κατά 30% έκφραση του γονιδίου CYP4P6 (σε σύγκριση με τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου στα δείγματα μάρτυρες) επέφερε αύξηση στα επίπεδα θνησιμότητας (21%) στα ενεμένα άτομα, κατά την εφαρμογή του εντομοκτόνου, σε σύγκριση με τους μάρτυρες (4% θνησιμότητα). Ο συγκεκριμένος φαινότυπος συνηγορεί υπέρ μιας πιθανής συμμετοχής της CYP4P6 στο μηχανισμό ανθεκτικότητας του δάκου στα πυρεθροειδή. Ωστόσο, η περιορισμένη διαθεσιμότητα δάκων δεν επέτρεψε την εξαγωγή ενός στατιστικά σημαντικού συμπεράσματος, στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής.Συμπερασματικά, αρκετά γονίδια αποτοξικοποίησης καταγράφηκαν ως υπερ-εκφραζόμενα βάσει των δεδομένων RNAseq, μετά την αλληλούχηση των MTs από ανθεκτικά και ευαίσθητα σε alpha- cypermethrin άτομα δάκου, παρέχοντας νέες πληροφορίες σχετικά με την αποτοξικοποίση των εντομοκτόνων σε αυτό το είδος. Ωστόσο, περαιτέρω μελέτες λειτουργικού χαρακτηρισμού των γονιδίων κρίνονται απαραίτητες. Μετά τα ενθαρρυντικά πρώτα αποτελέσματα που αναφέρονται στην παρούσα διερεύνηση (σχετικά με τον πιθανό ρόλο του γονιδίου CYP4P6), τα οποία ωστόσο χρήζουν περαιτέρω επιβεβαίωσης, οι ενδιαφέρουσες περιπτώσεις γονιδίων μπορούν να διερευνηθούν με in vitro πειράματα μεταβολισμού εντομοκτόνων, προκειμένου να διαλευκανθεί η πιθανή συμμετοχή τους στους μηχανισμούς αποτοξικοποίσης των εντομοκτόνων στο δάκο. Η απόκτηση αυτής της γνώσης μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη αποτελεσματικών στρατηγικών για την καταπολέμηση αυτού του επιβλαβούς εντόμου και την προστασία των ελαιόδεντρων, η καλλιέργεια των οποίων έχει μεγάλη οικονομική σημασία.Στην τρίτη ενότητα αυτής της διατριβής, προσεγγίστηκε η μοναδική ικανότητα του δάκου της ελιάς να χρησιμοποιεί άγουρες ελιές για την ανάπτυξή του, η οποία έχει συσχετιστεί με αλληλεπιδράσεις με συμβιωτικά βακτήρια. Στόχος αποτέλεσε να αναδειχθούν και να διερευνηθούν κρίσιμες πτυχές της μοναδικής αυτής συμβιωτικής σχέσης, μεταξύ του ξενιστή και του κυρίαρχου συμβιωτικού βακτηρίου Ca. E. dacicola, μέσω πειραμάτων μικροσκοπίας και ιστοειδικής μεταγραφικής ανάλυσης. Αρχικά, επιχειρήθηκε ο ποσοτικός προσδιορισμός του Ca. E. dacicola, κατά τη διάρκεια του κύκλου ζωής του δάκου, από το στάδιο της προνύμφης μέχρι το ενήλικο στάδιο, συγκρίνοντας μύγες που αναπτύσσονται σε άγουρες αλλά και σε ώριμες ελιές. Η μελέτη αυτή έγινε με χρήση ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο (RT-qPCR) και έδειξε έντονη διακύμανση μεταξύ των διαφορετικών αναπτυξιακών σταδίων. Επιπλέον, μέσω τεχνικών συνεστιακής μικροσκοπίας σάρωσης (confocal scanning imaging analysis), απεικονίστηκε το τμήμα του μεσεντέρου του δάκου, οι επονομαζόμενες τυφλές γαστρικές απολήξεις (gastric caeca), το οποίο φιλοξενεί τα συμβιωτικά βακτήρια κατά τα προνυμφικά στάδια του εντόμου και το οποίο διαπιστώσαμε ότι υπόκειται σε μορφολογικό μετασχηματισμό, ανάλογα με το αναπτυξιακό στάδιο της προνύμφης. Στη συνέχεια, αναλύθηκαν τα αποτελέσματα δύο συγκρίσεων, προκειμένου να μελετηθούν γονίδια τα οποία σχετίζονται αφενός με τον μετασχηματισμό και την ανάπτυξη του γαστρικού τυφλού και αφετέρου με τη ρύθμιση της συμβιωτικής σχέσης του δάκου με το Ca. E. dacicola. Πραγματοποιήθηκε λεπτομερής ανάλυση των δεδομένων, εστιάζοντας σε ορισμένες ομάδες γονιδίων που δυνητικά συμμετέχουν σε μηχανισμούς αυτής της συμβίωσης, καθώς και στον αναπτυξιακά ρυθμιζόμενο μετασχηματισμό του γαστρικού τυφλού.Οι νέες πτυχές οι οποίες παρουσιάζονται στην παρούσα μελέτη, σχετικά με τις αναπτυξιακές μεταβολές του δάκου της ελιάς και την αλληλεπίδρασή του με τον μητρικά κληρονομούμενο και απαραίτητο συμβιώτη, Ca. E. dacicola, μπορούν να αξιοποιηθούν στη μελλοντική ανάπτυξη καινοτόμων στρατηγικών διαχείρισης του εντόμου, οι οποίες θα στοχεύουν αυτήν την ιδιόμορφη συμβιωτική σχέση. Πιο ειδικά, η κατανόηση αυτής της συμβίωσης θα αποτελέσει τη βάση για την εγκαθίδρυση νέων προσεγγίσεων διαχείρισης του δάκου, μέσω του Ca. E. dacicola ή άλλων συμβιωτικών βακτηρίων, με χρήση μοριακών και κλασικών εργαλείων σε έξυπνες εφαρμογές.Συνολικά, τα δεδομένα που παρέχονται στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, δηλαδή η ανάπτυξη ενός ακριβούς εργαλείου γονιδιωματικής τροποποίησης για εφαρμογή στο δάκο (βασιζόμενο στο σύστημα CRISPR/Cas9) καθώς και τα δεδομένα αλληλούχησης RNA, τα οποία αναφέρονται στην ανάπτυξη ανθεκτικότητάς του σε εντομοκτόνα αλλά και στη συμβιωτικές του αλληλεπιδράσεις, παρέχουν πλέον τη δυνατότητα να μελετηθεί η μοριακή βάση διαφόρων μηχανισμών (ανθεκτικότητα σε εντομοκτόνα, συμβιωτικές σχέσεις με μικροοργανισμούς) με συστηματικό τρόπο. Η γνώση αυτή θα συμβάλλει στην ανάπτυξη καινοτόμων στρατηγικών καταπολέμησης του δάκου, οι οποίες θα διαφοροποιούνται από τις παραδοσιακές προσεγγίσεις και θα παρέχουν μια αποτελεσματική διαχείριση αυτού του καταστροφικού για την ελαιοπαραγωγή εντόμου.