Μελέτη του μικροβιώματος του ανώτερου αναπνευστικού συστήματος σε υγιή πληθυσμό της Βορείου Ελλάδος και έλεγχος της μεταβολής του σε αναπνευστικές λοιμώξεις

Abstract

While the germs that surround and found into the human body are recognized since the Koch’s time as a key factor for understanding and interpreting a variety of human diseases, very recently we have started to understand their crucial role in the maintenance of human health. The study of the human microbiome in health and disease is a new and rapidly evolving research field with main tools modern sequencing techniques. Deep sequencing methods enabled the evaluation of the composition of the microbial ecosystems that inhabit various anatomical sites of the human body, the exploration of their diversity and relative abundance, from phylum to species level, also giving the possibility to determine the relationship between microbiome and human health or disease. The purpose of the present study was to detect and classify the human microbiome in the pharynx (pharyngeal microbiome) by sequencing the 16S rRNA gene and to study its variety according to the examined population, gender, state of health, age, and environment. Further goal was the definition of a core microbiome in the pharynx of healthy subjects and the establishment of baselines capable of distinguishing normal pharynx flora between healthy and infected with respiratory diseases individuals. Another aim of the study was also to determine the factors that affect the composition of the pharyngeal microbiome and the way these factors interact with each other and to specify the possible role of composition changes in the microbiota of the upper respiratory niche in human health. Forty-six volunteers were enrolled into the study and twenty-nine of them (63%) were healthy. The relative abundance of microbial communities was determined by Next Generation (NGS) sequencing of the 16S rRNA gene on the Ion Torrent PGM platform. A total of 14 phyla, 138 families, 160 genera and 259 species were identified. The most abundant phyla were Proteobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes followed by Actinobacteria and Fusobacteria. At the genus level, the five most abundant genera in healthy volunteers were Streptococcus, Prevotella, Gemella, Veillonella and Neisseria, while in patients with respiratory infections the most abundant genera were Prevotella, Achromobacter, Streptococcus, Rhizobium and Veillonella. At the last taxonomic level of the species the five most abundant species in the healthy subjects were Gemella haemolysans, Prevotella histicola, Prevotella melaninogenica, Veillonella atypica and Prevotella salivae while in the patients Achromobacter spanius, Prevotella pallens, Rothia mucilaginosa and Prevotella melaninogenica. The linear discriminant analysis-linear effect size analysis (LDA-LEfSe) revealed 93 microbial species that could help differentiate pharyngeal microbiome between patients and healthy, 17 microbial species that could distinguish pharyngeal microbiome according to sex (male- female) and 35 microbial species that could classify the pharyngeal microbiome as that of smokers or non-smokers. A core microbiome in the pharynx was determined, using the R's Microbiome software package, for each group of subjects (men, women, controls and patients), and the construction of a network of interactions between the microbial taxa of the pharyngeal microbiome (package NetCoMi) revealed a hub in the microbiome of the male’s pharynx, the Lachnospiraceae family of phylum Firmicutes, which appears to play an important role in this anatomical region. The comparison of the pharyngeal microbiome between men and women revealed an increase of the microbial richness in men from phylum to species level. On the contrary, a reduction in the microbial richness observed in the pharyngeal microbiome of smokers compared to the pharyngeal microbiome of non-smokers. An increase in microbial diversity was also observed with age, and the 41-49 years age group had the richest pharyngeal microbiome, followed by subjects> 60 years of age. The study of a-diversity showed a statistically significant difference (p <0.05) between healthy and patients at the taxonomic level of phylum and genus. The analysis of b-diversity revealed also statistically significant difference between the same groups of subjects for all the taxonomic levels. Finally, the analysis of principal components (PCoA) revealed 35 microbial species that contributed most to the formation of PCoA axes in the distinction between healthy subjects and patients. The results of our study are a small part of the puzzle of the microbial species that colonize the human pharynx; however, it provides ways to study the composition and assessment of the pharynx microbiota diversity and aspires to be the basis for further research in the wider geographical area of Greece to understand the composition and diversity of the pharyngeal microbiome and how it varies depending on the environment, age, sex and state of health.

Ενώ τα μικρόβια, που περιβάλλουν τον άνθρωπο και βρίσκονται εντός του σώματος του, έχουν αναγνωρισθεί από την εποχή του Koch ως σημείο κλειδί για την κατανόηση και την ερμηνεία μιας ποικιλίας ασθενειών του ανθρώπου, μόλις πρόσφατα έχουμε αρχίσει να κατανοούμε και τον εξίσου κρίσιμο ρόλο τους στην διατήρηση της ανθρώπινης υγείας. Η μελέτη του ανθρώπινου μικροβιώματος στην υγεία και τη νόσο είναι ένα καινούριο και ταχέως εξελισσόμενο πεδίο έρευνας με κύρια εργαλεία τις σύγχρονες τεχνικές προσδιορισμού αλληλουχίας- NGS (Next Generation Sequencing). Οι μέθοδοι αλληλούχισης νέας γενιάς κατέστησαν δυνατή τη μελέτη και την αξιολόγηση της σύστασης των οικοσυστημάτων των μικροβίων που διαβιούν στις διάφορες ανατομικές περιοχές του ανθρώπινου σώματος, την εξερεύνηση της ποικιλομορφίας τους και της σχετικής τους αφθονίας μέχρι το επίπεδο του είδους, δίνοντας συγχρόνως τη δυνατότητα να προσδιοριστεί η σχέση του μικροβιώματος με την υγεία και τη νόσο στον άνθρωπο. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η ανίχνευση και ο ταξινομικός χαρακτηρισμός του ανθρώπινου μικροβιώματος στο φάρυγγα (φαρυγγικό μικροβίωμα) με τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του 16S rRNA γονιδίου, έτσι ώστε να καταστεί δυνατή η παραπέρα μελέτη της ποικιλίας του, ανάλογα με τον πληθυσμό που εξετάζεται, το φύλο, την κατάσταση της υγείας, την ηλικία και το περιβάλλον. Απώτερος στόχος ήταν ο καθορισμός στο φάρυγγα ενός πυρήνα μικροβιώματος (core microbiome), δηλαδή μικροοργανισμών που ανευρίσκονται σε όλα τα υγιή άτομα και η θέσπιση ορίων (baselines) ικανών να διακρίνουν τη φυσιολογική χλωρίδα του φάρυγγα υγιών ατόμων από την αντίστοιχη ατόμων που νοσούν από λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος. Στόχος της μελέτης επίσης, ήταν ο προσδιορισμός των παραγόντων που επηρεάζουν τη σύνθεση του φαρυγγικού μικροβιώματος, του τρόπου με τον οποίο οι ανωτέρω παράγοντες αλληλοεπιδρούν μεταξύ τους και του ρόλου που διαδραματίζουν οι μεταβολές στη σύνθεση του φαρυγγικού μικροβιώματος στην κατάσταση της υγείας του ανθρώπου. Υλικό της μελέτης αποτέλεσαν 46 εθελοντές εκ των οποίων 29 άτομα (63%) ήταν υγιή. Η σχετική αφθονία των μικροβιακών κοινοτήτων αναγνωρίστηκε με αλληλούχιση νέας γενιάς (NGS) του γονιδίου 16S rRNA στην πλατφόρμα Ion Torrent PGM.Συνολικά αναγνωρίστηκαν 14 φύλα (phyla),138 οικογένειες (families), 160 γένη (genera) και 259 είδη (species). Τα πιο άφθονα φύλα που ανιχνεύθηκαν ήταν τα Proteobacteria, Firmicutes και Bacteroidetes ακολουθούμενα από τα φύλα Actinbacteria και Fusobacteria. Όσον αφορά το επίπεδο του γένους, τα πέντε πιο άφθονα γένη στους υγιείς εθελοντές ήταν τα ακόλουθα Streptococcus, Prevotella, Gemella, Veillonella και Neisseria, ενώ στους πάσχοντες από λοίμωξη του αναπνευστικού συστήματος τα πιο άφθονα κατά σειρά συχνότητας γένη ήταν τα Prevotella, Streptococcus, Achromobacter, Rhizobium και Veillonella. Στο τελευταίο ταξινομικό επίπεδο του είδους τα πέντε πιο άφθονα είδη στους υγιείς ήταν τα Gemella haemolysans, Prevotella histicola, Prevotella melaninogenica, Veillonella atypica και Prevotella salivae ενώ στους ασθενείς τα Achromobacter spanius, Prevotella pallens, Prevotella melaninogenica, Rothia mucilaginosa και Veillonella atypica. Η ανάλυση γραμμικής διάκρισης μεγέθους αποτελέσματος (LDA-LEfSe) κατέδειξε 93 μικροβιακά είδη που θα μπορούσαν να συμβάλλουν στο διαχωρισμό του φαρυγγικού μικροβιώματος μεταξύ ασθενών και υγιών, 17 μικροβιακών ειδών που θα μπορούσαν να διακρίνουν το φαρυγγικό μικροβίωμα σε σχέση με το φύλο (άνδρας- γυναίκα) και 35 μικροβιακών ειδών που θα μπορούσαν να κατατάξουν το φαρυγγικό μικροβίωμα σε αυτό των καπνιστών ή των μη καπνιστών. Προσδιορίστηκε επίσης με τη βοήθεια του πακέτου λογισμικού Microbiome της γλώσσας R ένας πυρήνας φαρυγγικού μικροβιώματος για κάθε ομάδα των υποκείμενων της μελέτης (άνδρες, γυναίκες, υγιείς και ασθενείς), ενώ η δημιουργία δικτύου αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μικροβιακών ειδών που συνθέτουν το φαρυγγικό μικροβίωμα (με το πακέτο λογισμικού NetCoMi) αποκάλυψε έναν κεντρικό κόμβο (hub) στο μικροβίωμα του φάρυγγα των ανδρών, την οικογένεια Lachnospiraceae του φύλου Firmicutes που φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανατομική αυτή περιοχή. Από τη σύγκριση του φαρυγγικού μικροβιώματος ανδρών και γυναικών προέκυψε μεγαλύτερη ποικιλομορφία όσον αφορά τον μικροβιακό πλούτο (richness) του φαρυγγικού μικροβιώματος στους άνδρες σε όλα τα ταξινομικά επίπεδα από το φύλο (phylum) έως το είδος (species). Το αντίθετο, δηλαδή ελάττωση του μικροβιακού πλούτου όσον αφορά τον αριθμό των διαφορετικών μικροβιακών ειδών διαπιστώθηκε στο φαρυγγικό μικροβίωμα των καπνιστών σε σχέση με τους μη καπνιστές. Αύξηση της μικροβιακής ποικιλομορφίας διαπιστώθηκε επίσης και με την πρόοδο της ηλικίας, με πιο πλούσια ηλικιακή ομάδα όσον αφορά των αριθμό των διαφορετικών μικροβιακών ειδών την ομάδα 41-49 ετών, ακολουθούμενη από τα υποκείμενα ηλικίας >60 ετών. Κατά τη μελέτη της α- ποικιλομορφίας διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0,05) μεταξύ υγιών και ασθενών σε ταξινομικό επίπεδο φύλου και γένους, ενώ όσον αφορά τη β-ποικιλομορφία διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ ασθενών και υγιών μαρτύρων σε όλα τα ταξινομικά επίπεδα. Τέλος, με την ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCoA) ανευρέθηκαν 35 μικροβιακά είδη που συνέβαλλαν περισσότερο στο σχηματισμό των αξόνων της PCoA στην διάκριση υγιών και ασθενών. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας αποτελούν ένα μικρό μέρος από το παζλ που συνθέτει το σύνολο των μικροβιακών ειδών που αποικίζουν τον ανθρώπινο φάρυγγα, ωστόσο η παρούσα εργασία παρέχει τους τρόπους μελέτης της σύστασης και εκτίμησης της ποικιλομορφίας του φαρυγγικού μικροβιώματος και φιλοδοξεί να αποτελέσει τη βάση για περαιτέρω έρευνες στην ευρύτερη γεωγραφική περιοχή της Ελλάδας με σκοπό την καλύτερη κατανόηση της σύστασης και της ποικιλομορφίας του μικροβιώματος του φάρυγγα και του τρόπου που αυτό μεταβάλλεται ανάλογα με το περιβάλλον, την ηλικία, το φύλο και την κατάσταση της υγείας.