Διερεύνηση των παθογενετικών μηχανισμών της πνευμονικής ίνωσης και του καρκίνου του πνεύμονα

Abstract

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a rare fatal disease of interstitial pneumonia of unknown etiology. The disease is characterized by increased proliferation of fibroblasts and increased collagen deposition in the lungs, which is normally produced in wound healing. The pathogenesis remains unknown, however risk factors (genetic and environmental) appear to cause lung damage, resulting in the activation of fibroblasts, their differentiation into myοfibroblasts, which produce an excessive amount of extracellular matrix. 2015, the FDA approved 2 drugs for the treatment of pulmonary fibrosis, however so far they do not seem to completely cure, reducing mortality, but improve the living conditions of patients.The animal model of bleomycin is used to analyze the characteristics of IPF, which represents the basic characteristics of the disease in animals. In the context of research into new potential target molecules that could contribute to the progression of the disease, a study was initially conducted in which an attempt was made to optimize the bleomycin model. Two routes of administration (intratracheal and oropharyngeal) and different doses of bleomycin were tested and directly compared for the first time, using a variety of assays, including in vivo measurements of pulmonary function that are highly relevant to the clinical picture. Our results suggest that the OA route can be used as a safe and effective alternative route of BLM administration, allowing researchers to produce easily reproducible fibrotic profiles in conjunction with a beneficial safety profile that avoids invasive surgical procedures, results of higher doses of BLM. In addition, the low concentrations of BLM that used will allow drug testing in much better shaped animals without compromising a solid fibrotic profile. The etiology remains unknown but risk factors are genetic as well as environmental factors, among them epigenetic modifications. All enzymes that induce epigenetic modifications in the context of pulmonary fibromycin fibrosis were studied at the mRNA expression level. The study then focused on the Smyd3-histone methyltransferase gene, whose expression is increased in the fibrotic lungs. The bleomycin model was then applied to Smyd3 transgenic knock-out mice as well as control mice. However, the phenotype of the disease did not appear to change when the gene was silenced in all tissues.In addition, the Map3k8 gene and its role in pulmonary fibrosis were studied and it was found that MAP3K8 plays a central role in the pathogenesis of IPF involving the regulation of CoGE-2-induced PGE2 production in the lung.The genes whose expression changes in IPF and PF were then searched. From the data that emerged we focused on genes related to the extracellular matrix and more specifically the SH3PXD2A gene. The SH3PXD2A gene encodes the TKS5 adapter protein, whose main role is to promote signaling by binding to various other proteins, which can thus interact with each other. This protein is also involved in the formation of the actin cytoskeleton, which is a primary event in the differentiation of lung fibroblasts into myofibroblasts, as well as in the ability of certain cancer cells to penetrate. In addition, TKS5 contributes to extracellular matrix homeostasis through its interaction with Adams metalloproteases.Thus, for the first time, the increase of mRNA in but also of the protein of the SH3PXD2A / TKS5 gene was confirmed in fibroblasts after the induction of tgf-β1 in the form of rossettes. The protein cortactin, an adhesome molecule, a well-known indicator of podosomes, was also identified. Podosomes are known to induce the expression of metalloproteinases through the rossettes they create and induce the degradation of the extracellular matrix with the aim of migrating cells. In pulmonary fibrosis the migrating cells are myofibroblasts with the aim of enhancing the fibrotic pattern.For these reasons, after the genetic creation of Tks5-conditional knock out and heterozygous mice, the fibrotic model was applied to them either in vitro or in vivo. For further investigation and the possible effect of genetic targeting on the fibrotic phenotype, bleomycin-induced pulmonary fibrosis was performed in knock-out heterozygous mice (Sh3pxd2atm1b) and the corresponding control mice. Genetic targeting has led to an improvement in the fibrotic phenotype in all protocols compared to wild-type mice, in terms of inflammation, collagen concentration, assessment of respiratory function. This result could be explained by the fact that Tks5 after induction of tgf-β1 is a key component of podosomes and promotes ECM degradation through MmP9 and enhances migration. Thus, silencing the gene could inhibit the migration of myofibroblasts, thereby improving pulmonary fibrosis.In conclusion, half-genetic silencing of the Tks5 gene has led to an improvement in the experimental model of bleomycin, however more studies are needed on the mechanism leading to these results. Of course, the study of podosomes in pulmonary fibrosis in both humans and mice needs further investigation and other complementary experiments to clarify and prove the role of podosomes. Finally, this study is more interesting as podosomes play an important role in lung cancer and fibrosis is known to be a risk factor for lung cancer.

Η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση (IPF) είναι μια σπάνια θανατηφόρος μορφή διάμεσης πνευμονίας αγνώστου αιτιολογίας. Η νόσος χαρακτηρίζεται από αυξημένο πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών και αυξημένη εναπόθεση κολλαγόνου στον πνεύμονα, που φυσιολογικά παράγεται στην επούλωση πληγών. Η παθογένεια παραμένει άγνωστη, ωστόσο παράγοντες κινδύνου (γενετικοί και περιβαλλοντικοί) φαίνεται να προκαλούν βλάβες στον πνεύμονα, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των ινοβλαστών , την διαφοροποίηση τους σε μυο-ινοβλάστες , οι οποίοι παράγουν υπερβολική ποσότητας εξωκυττάριας μήτρας. Το 2015, ο FDA ενέκρινε 2 φάρμακα για τη θεραπεία της πνευμονικής ίνωσης, ωστόσο μέχρι στιγμής φαίνεται ότι δεν θεραπεύουν πλήρως, μειώνοντας τη θνητότητα, αλλά βελτιώνουν τις συνθήκες διαβίωσης των ασθενών.Για την ανάλυση των χαρακτηριστικών της IPF χρησιμοποιείται το ζωικό μοντέλο της μπλεομυκίνης, το οποίο αναπαριστά τα βασικά χαρακτηριστικά της νόσου σε ζώα. Στα πλαίσια της έρευσης νέων πιθανών μορίων στόχων που θα μπορούσαν να συμβάλλουν στην εξέλιξη της νόσου, πραγματοποιήθηκε αρχικά μια μελέτη στην οποία έγινε προσπάθεια για βελτιστοποίηση του μοντέλου της μπλεομυκίνης. Ελέγχθηκαν δυο οδοί χορήγησης (ενδοτραχειακά και οροφαρυγγειακά) και διαφορετικές δόσεις μπλεομυκίνης και συγκρίθηκαν άμεσα για πρώτη φορά, χρησιμοποιώντας μια πληθώρα δοκιμασιών, συμπεριλαμβανομένων in vivo μετρήσεις πνευμονικής λειτουργίας που είναι εξαιρετικά σχετικές με την κλινική εικόνα. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι η οδός ΟΑ μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια ασφαλής και αποτελεσματική εναλλακτική οδός χορήγησης BLM, επιτρέποντας στους ερευνητές να παράγουν εύκολα αναπαραγώγιμο ινωτικό προφίλ και σε συνδυασμό με ένα ευεργετικό προφίλ ασφάλειας που να αποφεύγει τις επεμβατικές χειρουργικές διαδικασίες, καθώς και τα συστηματικά αποτελέσματα των υψηλότερων δόσεων BLM. Επιπλέον, οι χαμηλές συγκεντρώσεις BLM που χρησιμοποιούνται θα επιτρέψουν τη δοκιμή φαρμάκων σε ζώα πολύ καλύτερου σχήματος, χωρίς να διακυβεύεται ένα στερεό ινωτικό προφίλ.Η αιτιοπαθογένεση παραμένει άγνωστη ωστόσο υπάρχουν παράγοντες κινδύνου γενετικοί αλλά και περιβαλλοντικοί παράγοντες, ανάμεσα σε αυτούς οι επιγενετικές τροποποιήσεις. Μελετήθηκαν σε επίπεδο έκφρασης mRNA όλα τα ένζυμα που επάγουν επιγενετικές τροποποιήσεις στα πλαίσια της πνευμονικής από μπλεομυκίνη ίνωση. Στη συνέχεια, η μελέτη επικεντρώθηκε στο γονίδιο Smyd3- μεθυλοτρανσφεράση ιστόνης , του οποίου η έκφραση αυξάνεται στους ινωτικούς πνεύμονες. Στη συνέχεια, το μοντέλο της μπλεομυκίνης εφαρμόστηκε σε διαγονιδιακά ποντίκια knock-out Smyd3 αλλά και στα ποντίκια ελέγχου. Ωστόσο ο φαινότυπος της ασθένειας δεν φάνηκε να αλλάζει όταν έγινε σίγηση του γονιδίου σε όλους τους ιστούς. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε το γονίδιο Map3k8, και ο ρόλος του στα πλαίσια της πνευμονικής ίνωσης και διαπιστώθηκε ότι η MAP3K8 έχει κεντρικό ρόλο στην παθογένεση της IPF που περιλαμβάνει τη ρύθμιση της παραγωγής PGE2 που προκαλείται από Cox-2 στον πνεύμονα.Στη συνέχεια αναζητήθηκαν τα γονίδια των οποίων η έκφραση μεταβάλλεται στην IPF αλλά και στην PF. Από τα δεδομένα που προέκυψαν επικεντρωθήκαμε σε γονίδια που σχετίζονται με την εξωκυττάρια μήτρα και πιο συγκεκριμένα με το γονίδιο SH3PXD2A. Το γονίδιο SH3PXD2A κωδικοποιεί την πρωτεΐνη προσαρμογέα TKS5, που βασικός της ρόλος είναι η προώθηση της σηματοδότησης, μέσω σύνδεσης με διάφορες άλλες πρωτεΐνες, οι οποίες έτσι μπορούν να αλληλοεπιδράσουν μεταξύ τους. Η πρωτεΐνη αυτή εμπλέκεται, επίσης στην διαμόρφωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, που αποτελεί πρωταρχικό γεγονός στην διαφοροποίηση των ινοβλαστών πνεύμονα σε μυοϊνοβλάστες, καθώς και στην ικανότητα διείσδυσης ορισμένων καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, η TKS5 συμβάλλει στην ομοιόσταση της εξωκυττάριας μήτρας, μέσω της αλληλεπίδρασης της με τις μεταλλοπρωτεάσες Adams. Για πρώτη φορά λοιπόν, επιβεβαιώθηκε η αύξηση του mRNA σε αλλά και της πρωτεΐνης του γονιδίου SH3PXD2A/TKS5, σε ινοβλάστες μετά την επαγωγή του tgf-β1 με την μορφή των ποσοδωμάτων-rossettes. Ακόμα συνεντοπίστηκε η πρωτεΐνη cortactin που είναι μόριο του adhesome , γνωστός δείκτης των ποδοσωμάτων. Τα ποδοσώματα είναι γνωστό ότι μέσω των rossettes που δημιουργούν επάγουν την έκφραση μεταλλοπρωτεινασών και επάγουν την αποικοδόμηση της εξωκυττάριας μήτρας με στόχο τη μετανάστευση των κυττάρων. Στην πνευμονική ίνωση τα κύτταρα που μεταναστεύουν είναι οι μυο-ινοβλάστες με στόχο την ενίσχυση του ινωτικού προτύπου.Για αυτούς τους λόγους, μετά την γενετική δημιουργία των Tks5-conditional knock out αλλά και των ετερόζυγων ποντικών, εφαρμόστηκε σε αυτά το ινωτικό μοντέλο είτε in vitro είτε in vivo. Για τη περαιτέρω διερεύνηση και την ενδεχόμενη επίδραση της γενετικής στόχευσης στον ινωτικό φαινότυπο, πραγματοποιήθηκε επαγώμενη από μπλεομυκίνη πνευμονική ίνωση σε ετερόζυγα knock-out (Sh3pxd2atm1b) ποντίκια και στα αντίστοιχα ποντίκια ελέγχου. Η γενετική στόχευση οδήγησε σε βελτίωση του ινωτικού φαινοτύπου σε όλα τα πρωτόκολλα σε σχέση με τα ποντίκια αγρίου τύπου, όσον αφορά τη φλεγμονή, την συγκέντρωση του κολλαγόνου, την εκτίμηση της αναπνευστικής λειτουργίας. Το αποτέλεσμα αυτό θα μπορούσε να εξηγηθεί με βάση το ότι το Τks5 μετά την επαγωγή του tgf-β1 είναι βασικό συστατικό των ποδοσωμάτων και προάγει μέσω της Μmp9 την αποικοδόμηση της ECM και ενισχύει τη μετανάστευση. Άρα , η σίγηση του γονίδιου θα μπορούσε να εμποδίζει την μετανάστευση των μυοινοβλαστών με αποτέλεσμα τη βελτίωση της πνευμονικής ίνωσης.Συμπερασματικά, η κατά το ήμισυ γενετική σίγηση του γονιδίου Tks5 οδήγησε σε βελτίωση του πειραματικού μοντέλου της μπλεομυκίνης, ωστόσο απαιτούνται περισσότερες μελέτες όσον αφορά το μηχανισμό που οδηγεί σε αυτά τα αποτελέσματα. Φυσικά η μελέτη των ποδοσώματων στην πνευμονική ίνωση τόσο στους ανθρώπους αλλά και στα ποντίκια χρειάζεται περισσότερο διερεύνηση και άλλα συμπληρωματικά πειράματα, ώστε να διευκρινιστεί και να αποδειχθεί ο ρόλος των ποδοσωμάτων. Τέλος, η μελέτη αυτή βρίσκει περισσότερο ενδιαφέρον καθώς τα ποδοσώματα παίζουν σημαντικό ρόλο στον καρκίνο του πνεύμονα και η ίνωση είναι γνωστό ότι αποτελεί κίνδυνο εμφάνισης του καρκίνου του πνεύμονα.