Σχεδιασμός και ανάπτυξη νέων θεραπευτικών μέσων έναντι μορίων ανοσιακής διαφυγής του χρυσίζοντα σταφυλόκοκκου (Staphylococcus aureus) για την αντιμετώπιση λοιμώξεων

Abstract

Staphylococcus aureus is a human pathogen that has an increasingly negative impact on human health. S. aureus can cause a broad range of potential inflammatory complications such as sepsis, endocarditis and toxic-shock syndrome. Its emerging antibiotic resistance and formidable immune evasion arsenal have emphasized the need for more effective approaches - such as the generation of monoclonal Abs- to neutralize virulence-promoting factors released by this pathogen. Complement is a crucial innate immune sentinel that protects from bacterial infection. S. aureus has been shown to produce proteins presenting complement inhibitory activity, such as Efb (Extracellular Fibrinogen Protein) and Eap (extracellular adherence protein). This study aimed at the development and evaluation of human recombinant antibodies that target key immune evasion mechanisms of S. aureus through Efb and Eap. Furthermore, our study addressed crucial structure-function interactions of Eap isoforms that dictate the virulence of various S. aureus strains.Initially we isolated donor-derived anti-EfbC IgGs that attenuate S. aureus survival through enhanced neutrophil killing. A phage library screen against EfbC yielded a panel of mini-Abs that displayed high selectivity for their target. All 12 mini-Abs were analyzed for their binding affinity and kinetics through an SPR-based approach. We also observed that specific mini-Abs (A1-A4) inhibit the binding of EfbC to C3 and its activated fragments C3b and C3d by disrupting contacts essential for complex formation. The inhibitory mini-Abs efficiently reversed the growth-promoting effect of Efb on S. aureus and decreased pathogen survival in a whole blood model of bacteremia. This neutralizing effect was associated with enhanced neutrophil-mediated killing of S. aureus, increased C5a production and modulation of IL-6 secretion. Finally, mini-Abs A1 and A2 afforded protection from S. aureus induced bacteremia in a murine renal abscess model, attenuating bacterial inflammation in kidneys.Gene silencing of another staphylococcal complement evasion molecule, Eap, decreased significantly the survival of S. aureus in a whole blood model of bacteremia, indicating that Eap is a valid target for the development of effective S. aureus-directed therapeutics. A human scFv library was therefore screened against the target protein Eap34 (Mu50) and the panning resulted in an scFv clone that selectively binds Eap (B1). SPR revealed binding of B1 to Eap-domain 4, however B1 did not inhibit Eap binding to C4b. Strikingly, addition of Eap and its complement modulatory fragment Eap34 enhanced S. aureus survival in a whole blood model of bacteremia while B1 significantly reversed this Eap-depended growth of S. aureus.To further delineate the effect of B1 blockade on various Eap isoforms, the two isoforms of Eap (Eap-Newman, Eap-Mu50) were produced and compared in terms of their S. aureus-growth promoting effect in whole blood. Eap-Mu50 increased significantly S. aureus survival in whole blood as compared to Eap-Newman. In addition, the Newman strain–encoded recombinant proteins Eap and Eap345 displayed higher binding affinity to fibrinogen compared to their Mu50-encoded counterparts. Moreover, Eap-Newman reduced neutrophil killing to a greater extent than Eap-Mu50, in agreement with its stronger complement C4b inhibitory activity over Eap-Mu50.Based on these findings, it is reasonable to hypothesize that reciprocal interactions between Eap and both the complement and coagulation systems determine the overall bacterial growth-promoting effect of Eap in whole blood. In this context, the stronger interaction of Eap-Newman with fibrinogen might mask its inhibitory effect on complement in a bacteremia setting.In conclusion, these studies have identified two mini-Abs A1 and A2 that present neutralizing activity against complement inhibitory protein Efb. The next step includes clinical evaluation of these Ab-based antimicrobial agents as leads for passive vaccination against staphylococcal infections. Moreover, this thesis provides the first evidence –at a molecular level- for a correlation between different isoforms of immune evasion proteins (Eap) and infectivity of different S. aureus strains. The long-term goal of this research is the development of a multivalent anti-serum composed of mAbs for passive vaccination against Staphylococcus aureus.

Ο χρυσίζων σταφυλόκοκκος (Staphylococcus aureus) αποτελεί ένα ευρέως διαδεδομένο παθογόνο βακτήριο που μπορεί να προκαλέσει οξείες δερματικές λοιμώξεις αλλά και δυνητικά θανατηφόρες φλεγμονώδεις επιπλοκές στον άνθρωπο όπως σηψαιμία, ενδοκαρδίτιδα και τοξικό σύνδρομο. Η αυξανόμενη ανθεκτικότητα πολλών στελεχών του S.aureus στα αντιβιοτικά καθιστά επιτακτική την ανάγκη ανάπτυξης νέων θεραπευτικών εργαλείων. Επιπλέον ο S. aureus παράγει ένα μεγάλο αριθμό ανοσορρυθμιστικών μορίων που αυξάνουν τη μολυσματικότητά του και επιδρούν και στους δύο βραχίονες της ανοσολογικής απόκρισης. Το συμπλήρωμα είναι μια σημαντική ομάδα πρωτεϊνών της φυσικής ανοσίας που προστατεύει τον ξενιστή από λοιμώξεις. Το παθογόνο βακτήριο S. aureus έχει αναπτύξει στρατηγικές ανοσοδιαφυγής με στόχο την εξουδετέρωση πρωτεϊνών του συμπληρώματος, εκκρίνοντας πρωτεΐνες όπως η Efb (Extracellular Fibrinogen Protein) και Eap (extracellular adherence protein).Σκοπός της διατριβής ήταν η ανάπτυξη και ο χαρακτηρισμός ανθρώπινων αντισωμάτων που θα στοχεύουν στην εξουδετέρωση της δράσης των σταφυλοκοκκικών πρωτεϊνών ανοσιακής διαφυγής Efb και Eap. Παράλληλα, τα αντισώματα αυτά και οι απομονωμένες πρωτεΐνες του S. aureus χρησιμοποιήθηκαν ως καλά χαρακτηρισμένα μοριακά εργαλεία για την διερεύνηση σχέσεων δομής -λειτουργίας των ισομορφών της Eap στα διάφορα στελέχη S.aureus.Αρχικά απομονώθηκαν εξουδετερωτικά anti-EfbC IgGs από το γενικό πληθυσμό που αναστέλλουν την αλληλεπίδραση του EfbC με το μόριο C3 και μειώνουν την επιβίωση του S.aureus ενισχύοντας τη φαγοκυτταρική δράση των ουδετερόφιλων. Στη συνέχεια ακολούθησε βιοχημικός χαρακτηρισμός ανθρώπινων ανασυνδυασμένων mini-αντισωμάτων που έχουν προέλθει από διαλογή βιβλιοθήκης έναντι της EfbC. Τα mini-αντισώματα εμφάνισαν υψηλή ειδικότητα δέσμευσης για το EfbC ενώ παράλληλα μελετήθηκε η κινητική δέσμευσής (Kd) τους στο μόριο EfbC. Βρέθηκε ότι επιλεγμένα mini-αντισώματα (Α1, Α2, Α3 και Α4) παρεμποδίζουν τη δέσμευση της EfbC στην πρωτεΐνη C3 και συγκεκριμένα στα C3b/C3d. Επίσης παρατηρήθηκε: i) σημαντική αύξηση της επιβίωσης του βακτηρίου παρουσία εξωγενούς Efb και EfbC και ii) σημαντική μείωση της επιβίωσης του βακτηρίου παρουσία των ανασταλτικών στην EfbC αντισωμάτων (τόσο με εξωγενή προσθήκη EfbC αλλά και με ενδογενώς παραγόμενο Efb) σε μοντέλο in vitro μόλυνσης ολικού αίματος.Επιπλέον βρέθηκε ότι τα ανασταλτικά mini-αντισώματα επαναφέρουν τα επίπεδα ενεργοποίησης συμπληρώματος (παραγωγή C5a), ενισχύουν τη φαγοκυττάρωση και μειώνουν την παραγωγή της IL-6 που αποτελεί δείκτη βακτηριακής λοίμωξης. Ακόμη τα mini-αντισώματα A1 και Α2 αναστέλλουν σημαντικά τη φλεγμονή και την εξάπλωση του S. aureus στο νεφρό σε in vivo μοντέλο βακτηριακής λοίμωξης.Οι μελέτες για την πρωτεΐνης ανοσιακής διαφυγής Eap έδειξαν ότι η αποσιώπηση του γονιδίου eap ελάττωσε σημαντικά την επιβίωση του S.aureus-Newman σε ολικό αίμα. Επομένως η Eap έχει σημαντική επίπτωση στη μολυσματικότητα του παθογόνου και αποτελεί σημαντικό μόριο–στόχο για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών αντισωμάτων.Διαλογή από βιβλιοθήκη ανθρώπινων αντισωμάτων μονής αλυσίδας έναντι της Eap34 κατέληξε σε επιλογή του κλώνου scFv Β1. Μελέτες βιοαισθητήρα SPR έδειξαν ότι το αντίσωμα scFv B1 δεσμεύεται εκλεκτικά στην επικράτεια 4 της Eap-Mu50 ωστόσο δεν αναστέλλει τη δέσμευση της Eap στο μόριο του συμπληρώματος C4b. Ακόμη σε in vitro δοκιμασίες μόλυνσης ολικού αίματος παρατηρήθηκαν: σημαντική αύξηση της επιβίωσης του βακτηρίου παρουσία εξωγενούς Eap και Eap34 και σημαντική μείωση της επιβίωσης του βακτηρίου παρουσία του scFv B1 αντισώματος (με εξωγενή προσθήκη Eap/Eap34).Ακολούθησαν μελέτες για την αξιολόγηση της δράσης των ισομορφών της Eap σε in vitro πειραματικά συστήματα. Στο πολυπαραγοντικό σύστημα του ολικού αίματος παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της επιβίωσης του S.aureus παρουσία της πρωτεΐνης ανοσιακής διαφυγής Eap-Mu50 σε σύγκριση με την αντίστοιχη Eap-Newman. Επιπλέον οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες Eap και Eap345 που παράγονται από το στέλεχος Newman δεσμεύονται ισχυρότερα στο ινωδογόνο σε σύγκριση με αυτές που παράγονται από το στέλεχος S.aureus Mu50. Ακόμη παρατηρήθηκε ότι η Eap-Newman μειώνει σημαντικά περισσότερο την κυτταροτοξική δράση των ουδετερόφιλων σε σύγκριση με την ισομορφή Eap-Mu50.Τα πειραματικά αποτελέσματα υποστηρίζουν την ταυτόχρονη αλληλεπίδραση των ισομορφών της Eap με τα συστήματα πήξης και συμπληρώματος στο αίμα και την πιθανή «κάλυψη» της ανασταλτικής δράσης της Eap-Newman έναντι του συμπληρώματος από την ισχυρή αλληλεπίδρασή της με το ινωδογόνο. Συμπερασματικά η παρούσα έρευνα οδήγησε στο χαρακτηρισμό εξουδετερωτικών αντισωμάτων έναντι μορίων ανοσιακής διαφυγής του S. aureus που μπορούν να υποβληθούν μελλοντικά σε κλινικές μελέτες για την αξιολόγηση της θεραπευτικής τους δράση ως συστατικά ενός πολυδύναμου αντι-ορού για την αντιμετώπιση λοιμώξεων. Ακόμη για πρώτη φορά μελετήθηκε –σε μοριακό επίπεδο- η συσχέτιση μεταξύ των διαφορετικών ισομορφών μιας πρωτεΐνης ανοσιακής διαφυγής (Eap) και της μολυσματικότητας των διαφορετικών στελεχών του S.aureus. Τελικός στόχος του πεδίου είναι η συμβολή στην παρασκευή ενός πολυδύναμου εμβολίου έναντι του παθογόνου βακτηρίου S. aureus.