Ανάπτυξη κυτταρογενετικών μεθοδολογιών για την εκτίμηση της ατομικής ακτινοευαισθησίας και αξιολόγηση σύγχρονων εξατομικευμένων τεχνικών ακτινοθεραπείας

Abstract

While technological advances in radiation oncology have led to a more precise delivery of radiation dose and to a decreased risk of side effects, there is still a need to better understand at the DNA and cytogenetic level the mechanisms underlying DNA damage response (DDR) and to overcome tumor resistance. ATM, ATR and Chk1 kinases are key mediators in DDR activation and crucial factors in treatment resistance. It is of importance, therefore, as an alternative to the conventional clonogenic assay, to establish a cytogenetic assay enabling reliable and time-efficient results in evaluating the potency of DDR inhibitors for radiosensitization. Towards this goal, the present study aims: 1. To develop and optimize a G2-chromosomal radiosensitivity assay using DDR and G2-checkpoint inhibitors as a novel modification compared to the classical G2-assay. 2. To investigate the strengths of this assay, as an alternative to the conventional clonogenic assay, for rapid radiosensitivity assessments of cultured cell lines, and potentially of primary tumor cells obtained from biopsies. 3. To examine the strengths and feasibility of the assay in enabling time-efficient results regarding the evaluation of the potency of DDR inhibitors in radiosensitizing cells. Specifically, exponentially growing RPE and 82-6 hTERT human cells were irradiated during G2/M-phase transition in the presence or absence of Caffeine, VE-821 and UCN-1 inhibitors of ATM/ATR, ATR and Chk1 respectively, and the induced chromatid breaks were used to evaluate cell radiosensitivity and their potency for radiosensitization. The results generated here led to the development and optimization of a modified G2-assay using the VE-821 ATR inhibitor enabling time-efficient radiosensitivity assessments of cultured cells, and potentially of primary tumor cells obtained from biopsies. The results also, highlight the potential of our modified G2-assay using VE-821 to evaluate cell radiosensitivity, the efficacy of DDR inhibitors in radiosensitization, and reinforce the concept that ATM, ATR and Chk1 represent attractive anticancer drug targets in radiation oncology.Τhere is also a need to evaluate the efficacy of the new radiotherapy techniques estimating the biological dose and to investigate the radiobiological impact of the dose rate in advanced radiotherapy techniques. The aim of this experimental part is to compare, at a cytogenetic level, advanced radiotherapy techniques VMAT and IMRT with the conventional 3D-CRT, using biological dosimetry. A dicentric biodosimetry assay, based on the frequency of dicentrics chromosomes scored in peripheral blood lymphocytes from prostate cancer patients and PC3 human prostate cancer cell line was used. For each patient blood sample and for the cell line, three different irradiations were performed using the 3D-CRT, IMRT and VMAT technique. The absorbed dose was estimated with the biodosimetry method based on the induced dicentric chromosomes. The results showed a statistically significant underestimation of the biological absorbed dose of ~4% for the IMRT and VMAT compared to 3D-CRT irradiations for peripheral blood lymphocytes, whereas IMRT and VMAT results were comparable without a statistically significant difference, although slightly lower values were observed for VMAT compared to IMRT irradiation. Similar results were obtained using the PC3 cell line. The observed biological dose underestimation could be associated with the relative decreased dose rate met in modulated techniques compared to the conventional 3D-CRT irradiations.

Παρόλο που οι σύγχρονες τεχνικές ακτινοθεραπείας επιτρέπουν την αύξηση της δόσης στον όγκο-στόχο για μεγιστοποίηση του ποσοστού ίασης της νόσου και ελαχιστοποίηση της δόσης στους υγιείς ιστούς, υπάρχει σημαντική ανάγκη να κατανοήσουμε καλύτερα τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στο πολύπλοκο δίκτυο της κυτταρικής απόκρισης στις ακτινοεπαγόμενες βλάβες του DNA γνωστό ως “DNA Damage response” (DDR), καθώς και να υπερνικήσουμε την ακτινοαντοχή του όγκου. Οι ATM, ATR και Chk1 είναι οι βασικές κινάσες που εμπλέκονται άμμεσα στην ενεργοποίηση του DDR και την αντοχή του όγκου στην ακτινοβολία. Είναι σημαντικό επομένως, να καθιερωθεί μία κυτταρογενετική δοκιμασία (assay) έναντι της συμβατικής κλωνογόνου δοκιμασίας (clonogenic assay) που να προσφέρει αξιόπιστα και γρήγορα αποτελέσματα για την εκτίμηση τόσο της ακτινοευαισθησίας όσο της ακτινοευαισθητοποίησης των κυττάρων με τη χρήση αναστολέων DDR. Η παρούσα διατριβή στοχεύει: (1) Στην ανάπτυξη μιας κυτταρογενετικής μεθόδου (G2-assay) για την εκτίμηση της χρωμοσωματικής ακτινοευαισθησίας χρησιμοποιώντας αναστολείς του DDR και του σημείου ελέγχου G2/M του κυτταρικού κύκλου. (2) Στην αξιολόγηση του G2-assay, ως εναλλακτική έναντι της συμβατικής κλωνογόνου δοκιμασίας (clonogenic assay) ως προς το χρόνο που απαιτείται για την ανάλυση των αποτελεσμάτων. (3) Στην ανάδειξη των πλεονεκτημάτων της μεθοδολογίας που αναπτύσεται στα πλαίσια της παρούσας διατριβής ως εργαλείο για τη διερεύνηση της αποτελεσματικότητας διαφορετικών αναστολέων του DNA Damage response – DDR για την ακτινοευαισθητοποίηση των κυττάρων. Σε αυτό το μέρος της πειραματικής διαδικασίας, ανθρώπινες κυτταρικές σειρές (ινοβλάστες 82-6 hTERT και επιθηλιακά κύτταρα RPE) ακτινοβολήθηκαν κατά τη διάρκεια της μετάβασής τους από τη φάση G2 του κυτταρικού τους κύκλου στη Μίτωση (Μ), και αξιολογήθηκε η συμβολή της αναστολής των οδών ATR, ATM και Chk1 αναλύοντας τις επαγόμενες χρωματιδικές αλλοιώσεις. Τα πειράματα διεξήχθησαν με κύτταρα που επωάστηκαν με καφεΐνη (αναστολέας ATM/ATR), με VE-821 (αναστολέας της ATR) και με UCN-01 (αναστολέας Chk1) ώστε να επιτευχθεί η κατάργηση της ενεργοποίησης του G2/Μ σημείου ελέγχου. Τα πειραματικά αποτελέσματα οδήγησαν στην ανάπτυξη και βελτιστοποίηση ενός τροποποιημένου G2-assay που υιοθετεί τον ATR αναστολέα VE-821, επιτρέποντας τη σύντομη χρονικά εκτίμηση της ακτινοευαισθησίας των κυττάρων. Η συνδυασμένη αυτή μεθοδολογία θα μπορούσε επίσης να χρησιμοποιηθεί ως ένα αξιόπιστο εργαλείο για τον έλεγχο της ακτινοευαισθητοποίησης που θα μπορούσαν να επιφέρουν μελλοντικοί αναστολείς DDR. Επίσης, τα αποτελέσματά του μέρους αυτού της διατριβής ενισχύουν την ιδέα ότι τα ATM, ATR και Chk1 αποτελούν ελκυστικούς στόχους φαρμάκων στην ογκολογία.Επιπλέον, υπάρχει σημαντική ανάγκη για περαιτέρω διερεύνηση της αποτελεσματικότητας των νέων τεχνικών ακτινοθεραπείας εκτιμώντας την απορροφούμενη δόση με κυτταρογενετικές μεθόδους βιοδοσιμετρίας, καθώς και για τη διερεύνηση της πιθανής επίδρασης του ρυθμού δόσης των νέων τεχνικών στο βιολογικό αποτέλεσμα. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής εξήχθησαν αποτελέσματα σχετικά με την απορροφούμενη δόση σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος και σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη PC3, μετά από ακτινοβόληση με τρεις διαφορετικές τεχνικές ακτινοθεραπείας (3D-CRT, IMRT και VMAT) με συνταγογραφούμενη δόση 2Gy. Για κάθε δείγμα αίματος ασθενούς και για τα κύτταρα PC3, πραγματοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές ακτινοβολήσεις χρησιμοποιώντας τις τεχνικές 3D-CRT, IMRT και VMAT με δόση 2 Gy. Η απορροφούμενη δόση υπολογίστηκε με τη μέθοδο βιοδοσιμετρίας η οποία βασίζεται στην ανίχνευση δικεντρικών χρωµοσωµάτων σε κύτταρα. Τα αποτελέσματα της διατριβής έδειξαν μία υποεκτίμηση της απορροφούμενης δόσης της τάξης του ~4% για τις τεχνικές IMRT και VMAT συγκριτικά με τη συμβατική 3D-CRT ενώ δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά για τις τεχνικές VMAT και IMRT. Η παρατηρούμενη υποεκτίμηση της απορροφούμενης δόσης στα κύτταρα με τις τεχνικές VMAT και IMRT, πιθανόν να οφείλεται στο μικρότερο ρυθμό δόσης που επιτυγχάνεται με τις τεχνικές αυτές.