Μελέτη και χαρακτηρισμός ενζύμων για την αντιμετώπιση της ανθεκτικότητας έναντι βιοτικών και αβιοτικών παραγόντων

Abstract

Multiple Resistance whether is referred to Herbicide Resistance or Antimicrobial Resistance is an omnipresent situation which has been recognized as the negative outcome of the constant and repeated application of pesticides (e.g. herbicides, insecticides etc) in crop production and antibiotics in the combat of infectious diseases. The current situation has become a global threat that jeopardizes public healthcare and the sustainability of the agricultural sector. The successful and intense application of antimicrobial compounds as well as of pesticides has led to the emergence of increasingly alarming phenomena of resistance due to anthropogenic selective pressure caused by the reduction of the numbers in target microorganisms or weeds. In view of multiple resistance, the current project focuses on two distinct aspects of this phenomenon and is divided in two main parts. The first part is dedicated to resistance phenomena which are attributed to biotic factors. One such biotic factor refers to multiple resistant pathogenic bacteria which are responsible for a plethora of infectious diseases in a global scale due to antibiotic resistance. The cause of direct threat to human health sets the path for research and development in novel antibacterial agents. The second part deals with multiple resistance phenomena caused by abiotic agents. From this perspective, the abiotic agents are defined as the non-effective herbicides that fail to counteract multiple herbicide resistant weeds in crop cultures. As the main objective of the current project has been the discovery and evaluation of novel agents capable of alleviating multiple resistance, the first steps deal with the problem of antibiotic resistance mostly aiming at the multi-resistant pathogenic bacteria Acinetobacter baumannii and Staphylococcus aureus. The discovery of novel enzymes, originating from bacteriophages, which function as cell wall peptidoglycan hydrolases against Gram-positive and Gram-negative bacteria has become the primary goal. The use of phage therapy or phage-derived enzymes against bacterial diseases has not been a new strategy. However, the requirement of enzymes with unique physicochemical properties can be fulfilled by investigating extreme environmental conditions. For that reason, the hot springs of the island of Lesvos have been selected as an example of extreme conditions. Initially, soil samples were collected from four different locations on the island and, subsequently, total genomic DNA extraction was achieved. Afterwards, 16S Marker Gene Analysis was carried out using the V3-V4 hypervariable region of 16S rRNA gene, aiming at the investigation of the bacterial communities that thrive in these environments. Α general overview of the bacterial communities led to the identification of a small number of thermophilic and hyperthermophilic bacterial species. Direct search for peptidoglycan hydrolases based on the nearly identified species allowed the design of primers targeting homologous proteins. The investigation of the genomic libraries resulted in the finding of at least one enzyme coding for a N-acetylmuraloyl-L-Alanine amidase type 2 (NALAA 2), which exhibits acidophilic properties, as it functions at low pH values, and displays increased thermostability. Moreover, it appears to show substrate preference for bacteria belonging to the genus Staphylococcus. At the same time, a comparative study was implemented using peptidoglycan hydrolases, namely LysK from phage K infecting S. aureus and LysAB2 from phage AB2 infecting A. baumannii. Both enzymes exhibit lower thermal stability compared to the new amidase, however, LysK seems to exhibit a wider substrate specificity.The second part of the research project was dedicated to the problem of multiple herbicide resistance (MHR) which has been observed in grass weeds due to overuse of herbicides. Alopecurus myosuroides and Lolium rigidum belong to the list of weeds that exhibit significantly high levels of herbicide resistance. High levels of resistance have been correlated with increased expression levels of the class Phi glutathione transferases (GSTFs). Four GSTFs, two from grass weeds, namely Alopecurus myosuroides GSTF (AmGSTF) and Lolium rigidum GSTF (LrGSTF), and two from crop plants, namely Triticum aestivum GSTF (TaGSTF) and Hordeum vulgare GSTF (HvGSTF), were characterized and subjected to inhibition experiments in order to find new inhibitors from already well-established compound libraries. The combination of these inhibitors with commercially available pesticides was also an experimental approach intended to resistance phenotype mitigation. Furthermore, the crystal structure of two GSTFs (AmGSTF and LrGSTF) was determined, providing knowledge on the mechanisms which lead to resistance and allowing the design of a 3D pharmacophore in order to interpret the MHR-GSTFs inhibition mechanism.

Το φαινόμενο της γενικευμένης πολλαπλής ανθεκτικότητας, που πλέον παρατηρείται κατά την εφαρμογή παρασιτοκτόνων (π.χ. ζιζανιοκτόνων, εντομοκτόνων κ.τ.λ.), αλλά και κατά τη χορήγηση θεραπευτικών σκευασμάτων στον τομέα της υγείας, όπως είναι τα αντιβιοτικά, αντι-ρετροϊικά κ.ά. έχει καταστεί παγκόσμια απειλή και αποτελεί μείζον ζήτημα για την αειφορία του αγροτικού τομέα και της δημόσιας υγείας, αντίστοιχα. Η επιτυχής αλλά και εντατική εφαρμογή των αντιμικροβιακών ενώσεων, καθώς και των παρασιτοκτόνων, οδήγησε σε επαναλαμβανόμενα φαινόμενα ανθεκτικότητας, τα οποία οφείλονται κυρίως στο αποτέλεσμα της ανθρωπογενούς εξελικτικής πίεσης, που εφαρμόζεται λόγω μείωσης των πληθυσμών των ανεπιθύμητων μικροοργανισμών ή ζιζανίων. Στα πλαίσια της πολλαπλής ανθεκτικότητας, επιλέχθηκαν περιπτώσεις εμφάνισης του φαινομένου αυτού, οι οποίες διακρίνονται σε δύο βασικούς άξονες. Ο πρώτος περιλαμβάνει το φαινόμενο της πολλαπλής ανθεκτικότητας που εμφανίζεται σε βιοτικούς παράγοντες. Ένας σχετικός βιοτικός παράγων είναι τα πολυανθεκτικά βακτήρια, τα οποία προκαλούν επικίνδυνες λοιμώξεις σε όλο τον κόσμο, λόγω φαινομένων ανθεκτικότητας έναντι των αντιβιοτικών. Η άμεση απειλή για την ανθρώπινη υγεία καθοδηγεί την έρευνα στην ανάπτυξη νέων και καινοτόμων αντιβακτηριακών ενώσεων. Ο δεύτερος άξονας περιλαμβάνει την πολλαπλή ανθεκτικότητα, που οφείλεται σε αβιοτικούς παράγοντες, όπως τα ζιζανιοκτόνα, που σκοπό έχουν τον έλεγχο των πολυανθεκτικών ζιζανίων στις αγροτικές καλλιέργειες. Έχοντας σαν απώτερο σκοπό την εύρεση καινοτόμων τρόπων αντιμετώπισης της ανθεκτικότητας, επιχειρήθηκε, αρχικά, η έρευνα στο πεδίο των πολυανθεκτικών βακτηρίων, με ιδιαίτερη έμφαση στα βακτήρια Acinetobacter baumannii και Staphylococcus aureus. Το ζητούμενο ήταν η εξεύρεση ενός τρόπου αντιμετώπισης μέσω υδρολυτικών ενζύμων (ενδολυσίνες), που προέρχονται από βακτηριοφάγους, τα οποία έχουν την ικανότητα να υδρολύουν την πεπτιδογλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος των θετικών και αρνητικών κατά Gram βακτηρίων. Αν και η προσέγγιση είναι γνωστή από πιο παλιά, η διαφοροποίηση έρχεται ως προς την εξεύρεση ενζύμων με ιδιαίτερα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά επιλέγοντας ως πηγή αναζήτησης μεταγονιδωματικές βιβλιοθήκες προερχόμενες από ακραία περιβάλλοντα βιοποικιλότητας. Για το σκοπό αυτό, επιλέχθηκε το περιβάλλον των θερμών πηγών από το νησί της Λέσβου. Με δειγματοληψίες χώματος σε τέσσερις διαφορετικές τοποθεσίες του νησιού, έγινε απομόνωση του ολικού γονιδιωματικού DNA και, στη συνέχεια, ακολούθησε αλληλούχηση της υπερμεταβλητής περιοχής V3-V4 του 16S rRNA με σκοπό τη μελέτη των βακτηριακών κοινοτήτων που αναπτύσσονται στα εν λόγω περιβάλλοντα. Η γενική επισκόπηση της βακτηριακής κοινότητας που υπάρχει, οδήγησε στην κατά προσέγγιση ταυτοποίηση ορισμένων θερμόφιλων και υπερθερμόφιλων βακτηριακών ειδών, όπου για την αναζήτηση γονιδίων υδρολασών της πεπτιδογλυκάνης σχεδιάστηκαν εκκινητές για την εξεύρεση ομόλογων ακραιόφιλων ενζύμων. Η αναζήτηση οδήγησε στην ανακάλυψη μιας Ν-ακετυλομουραμοϋλ-L-αλανινο-αμιδάσης της πεπτιδογλυκάνης τύπου 2 (NALAA 2), η οποία παρουσιάζει οξεόφιλο χαρακτήρα, καθώς λειτουργεί σε περιβάλλον όξινου pH, και αυξημένη θερμική σταθερότητα, ενώ ταυτόχρονα, φαίνεται να εμφανίζει εξειδίκευση ως προς τα βακτήρια του γένους Staphylococcus. Παράλληλα, έγινε συγκριτική μελέτη δύο υδρολασών της πεπτιδογλυκάνης, της LysK από τον βακτηριοφάγο Κ, που προσβάλλει τον S. aureus, και της LysAB2 από τον βακτηριοφάγο ΑΒ2 που προσβάλλει το A. baumannii. Τα δύο προαναφερθέντα ένζυμα εμφανίζουν συγκριτικά χαμηλότερη θερμική σταθερότητα σε σχέση με την αμιδάση της θερμής πηγής, ωστόσο, ως προς την εξειδίκευση, η LysK παρουσιάζει το μεγαλύτερο εύρος δράσης. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης, πραγματοποιήθηκε μελέτη ενζύμων, που εμπλέκονται στην εμφάνιση της πολλαπλής ανθεκτικότητας που αναπτύσσεται σε ζιζάνια εξαιτίας της εφαρμογής των ζιζανιοκτόνων. Δύο ζιζάνια τα οποία εμφανίζουν ιδιαίτερα αυξημένα επίπεδα πολυανθεκτικότητας είναι το Alopecurus myosuroides και το Lolium rigidum. Τα υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας έχουν συνδεθεί με αυξημένα επίπεδα έκφρασης του ενζύμου τρανσφεράση της γλουταθειόνης που ανήκει στην τάξη Phi (GSTF). Επιλέγοντας τις συγκεκριμένες GSTFs (AmGSTF και LrGSTF), καθώς και δύο ομόλογες αλληλουχίες από τα καλλιεργούμενα φυτά Triticum aestivum (TaGSTF) και Hordeum vulgare (HvGSTF) έγινε συγκριτική μελέτη των τεσσάρων ενζύμων και αξιολόγηση της ικανότητας ενός συνόλου ενώσεων, να προκαλεί αναστολή στα εν λόγω ένζυμα. Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν η συνδυαστική χρήση με ήδη υπάρχοντα εμπορικά σκευάσματα ζιζανιοκτόνων για τον μετριασμό των φαινομένων ανθεκτικότητας. Επιπρόσθετα, επιλύθηκε η κρυσταλλική δομή δύο εξ αυτών (AmGSTF και LrGSTF), γεγονός που παρέχει περισσότερη γνώση ως προς τον μηχανισμό δράσης των ενζύμων αυτών, που συμβάλλουν στην πολυανθεκτικότητα, αλλά και ως προς την ευκολία σχεδιασμού ειδικού φαρμακοφόρου για την πρόκληση αναστολής της ενζυμικής δράσης.