Deciphering the three-way interaction among Bacillus amyloliquefaciens MBI600, plants and phytopathogenic bacteria

Abstract

The objective of this study was to elucidate the mechanisms of the three-way plant-B. amyloliquefaciens MBI600-bacterial pathogen interaction. A holistic approach was implemented; at first, the bactericidal activity of B. amyloliquefaciens MBI600 was evaluated in vitro and in planta against various bacterial pathogens. MBI600 showed antibacterial activity in vitro against both gram- and gram+ species. Among the tested species, Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Ralstonia solanacearum, and Xanthomonas spp. were of high susceptibility, Erwinia amylovora of intermediate susceptibility and E. chrysanthemi and Pseudomonas spp. of low/no susceptibility.Foliar application of Serifel, the commercial formulation of MBI600, inhibited infection of tomato plants by the soil-borne phytopathogen R. solanacearum. It also displayed biocontrol activity against X. campestris pv. vesicatoria and reduced disease symptoms caused by P. syringae pv. tomato, even if its population density was not affected significantly. In support, wildfire disease development and population density of its causing agent were impaired significantly in Nicotiana benthamiana leaves. MBI600 produced and secreted bacillibactin, a catecholate siderophore, under iron depletion growth conditions. In vitro and in planta tests suggested that production of bacillibactin resulted in a broadening of the MBI600 target range among phytopathogens. The ability of MBI600 to colonize different plant was also evaluated. Results suggested that ΜΒΙ600 effectively colonized, in a dose-dependent manner, tomato and corn roots as well as leaves of tomato, N. benthamiana and lettuce plants following Serifel application. Furthermore, microbiological tests and expression of genes involved in rhizosphere competence revealed that colonization is facilitated by root exudates and elicitors from competitive species, which enhanced swarming of MBI600 and synthesis of bactericidal antibiotics. Finally, the activation of immune responses of tomato plants in the presence of MBI600 or its metabolites was investigated based on the expression of defense-related genes and transcriptomic analysis. Foliar application of Serifel activated defense mechanisms in a dose-dependent manner; low dosage activated only SA-responsive genes (npr1, pr1b1) whereas use of suggested dosage resulted in the activation of all JA/ET-responsive genes assessed (erf1, loxD, myc2), while the SA signaling pathway was still active. These results suggested a synergy between SA and JA/ET – responsive pathways, which was confirmed in experiments using MBI600 metabolites. Furthermore, MBI600 metabolites suppressed absisic acid and enhanced auxin signaling pathways. They also activated components of Jasmonic acid (JA) and ethylene (ET) biosynthesis and signaling pathways. In contrast to leaf application, CFCF did not affect SA-responsive genes targeted in this study.

Σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διασαφηνιστούν οι μηχανισμοί της τριπλής αλληλεπίδρασης μεταξύ του βιολογικού παράγοντα Β. amyloliquefaciens MBI600, φυτών και φυτοπαθογόνων βακτηρίων. Για τον σκοπό αυτό εφαρμόστηκε μια ολιστική προσέγγιση. Αρχικά, αξιολογήθηκε η βακτηριοκτόνος δράση του B. amyloliquefaciens ΜΒΙ600, in vitro και in planta, έναντι διαφόρων βακτηριακών παθογόνων. Στα in vitro πειράματα, το στέλεχος ΜΒΙ600 εμφάνισε αντιβακτηριακή δράση τόσο εναντίον Gram- όσο και Gram+ βακτηριακών ειδών. Μεταξύ των ειδών που ελέγχθηκαν, τα είδη Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Ralstonia solanacearum και Xanthomonas spp. εμφάνισαν υψηλή ευαισθησία, το είδος Erwinia amylovora χαμηλή ευαισθησία ενώ το είδος Ε. chrysanthemi και όλα τα είδη του γένους Pseudomonas spp. δεν εμφάνισαν καθόλου ευαισθησία.Όσον αφορά τα in planta πειράματα, η εφαρμογή του εμπορικού σκευάσματος του ΜΒΙ600, Serifel, σε φύλλα τομάτας ανέστειλε τη μόλυνση από το φυτοπαθογόνο βακτήριο εδάφους R. solanacearum. Επίσης, ήταν ικανή να ελέγξει σημαντικά τα συμπτώματα της ασθένειας της βακτηριακής κηλίδωσης που προκαλείται από το είδος X. campestris pv. vesicatoria αλλά και της ασθένειας της βακτηριακής στιγμάτωσης της τομάτας που οφέιλεται στην μόλυνση από το είδος Ρ. syringae pv. tomato, ακόμη και αν η πυκνότητα του πληθυσμού δεν επηρεάστηκε σημαντικά. Επιπλέον, παρατηρήθηκε σημαντική μείωση τόσο των συμπτωμάτων της ασθένειας του βακτηριακού καψίματος της τομάτας όσο και της πυκνότητας του πληθυσμού του αιτίου της μόλυνσης, P. syringae pv. tabaci, σε φυτά Nicotiana benthamiana. In vitro πειράματα επιβεβαίωσαν ότι το στέλεχος MBI600, υπό συνθήκες έλλειψης σιδήρου, παράγει και εκκρίνει τον κατεχολικό σιδηροφορέα, bacillibactin. Τόσο οι δοκιμές in vitro όσο και in planta έδειξαν ότι η παραγωγή της bacillibactin είχε σαν αποτέλεσμα τη ενίσχυση της αντιμικροβιακής δράσης του ΜΒΙ600 μεταξύ των φυτοπαθογόνων βακτηρίων.Ακολούθως, προσδιορίστηκε η ικανότητα του στελέχους MBI600 να αποικίζει διαφορετικά είδη φυτικών ξενιστών. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι το στέλεχος ΜΒΙ600 είναι ικανό να αποικίζει αποτελεσματικά τις ρίζες φυτών τομάτας και καλαμποκιού, καθώς και τα φύλλα φυτών τομάτας, Ν. Benthamiana και μαρουλιού, μετά την εφαρμογή του Serifel, κατά τρόπο δοσοεξαρτώμενο. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας μικροβιολογικές δοκιμές και ποσοτική PCR αποδείχθηκε ότι τόσο οι εκκρινόμενες ουσίες της ρίζας όσο και τα φυτοπαθογόνα βακτήρια διεγείρουν την παραγωγή αντιβιοτικών του στελέχους ΜΒΙ600, την ομαδική κινητοποίηση και τον ανταγωνισμό. Τέλος, το εμπορικό στέλεχος B. amyloliquefaciens MBI600 αξιολογήθηκε ως προς την ικανότητά του να επάγει την ISR μετά από εφαρμογή με ριζοπότισμα ή ψεκασμό φύλλων φυτών τομάτας. Επίσης, το Φιλτραρισμένο Υπερκείμενο Κυτταρικής Καλλιέργειας (ΦΥΚΚ) του ΜΒΙ600 δοκιμάστηκε σε φυτά και σπορόφυτα τομάτας. Τα επίπεδα έκφρασης 23 γονιδίων-δεικτών, που εμπλέκονται σε μονοπάτια σηματοδότησης του σαλικυλικού οξέος (SA) και των αιθυλενίου/γιασμονικού οξέος (ET/JA), αξιολογήθηκαν με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου. Η εφαρμογή του Serifel στο φύλλο ενεργοποίησε τους αμυντικούς μηχανισμούς των φυτών με τρόπο δοσοεξαρτώμενο. Η χαμηλή συγκέντρωση ενεργοποίησε γονίδια του μονοπατιού σηματοδότησης του SA (npr1, pr1b1). Από την άλλη μεριά, η χρήση της προτεινόμενης συγκέντρωσης του Serifel είχε ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση όλων των γονιδίων απόκρισης των μονοπατιών σηματοδότησης των JA / ET που αξιολογήθηκαν (erf1, loxD, myc2), διατηρώντας ενεργό το μονοπάτι σηματοδότησης του SA. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν μια συνέργεια μεταξύ των μονοπατιών του SA και των JA / ET, κάτι που επιβεβαιώθηκε και με παρόμοια ανάλυση μετά την εφαρμογή των μεταβολιτών (ΦΥΚΚ) του MBI600. Επιπλέον, οι μεταβολίτες MBI600 κατέστειλαν το μονοπάτι σηματοδότησης του αμπσισικού (ΑΒΑ) ενώ ενίσχυσαν αυτό της αυξίνης. Επίσης, ενεργοποίησαν συστατικά των οδών βιοσύνθεσης και σηματοδότησης του γιασμονικού οξέος (JA) και του αιθυλενίου (ΕΤ). Σε αντίθεση με την εφαρμογή στο φύλλο, το ΦΥΚΚ δεν επηρέασε τα υπό μελέτη γονίδια που σχετίζονται με το μονοπάτι σηματοδότησης του SA.