The Smyd5 protein promotes the develpoment of heppatocellular carcinoma in mice

Abstract

BACKGROUND: SMYD5 is a Su(Var)3-9, Enhancer-of-zeste and Trithorax (SET) and Myeloid, Nervy, and DEAF-1 (MYND) domain-containing histone methyltransferase, which was originally described as a component of the nuclear receptor corepressor (NCoR) complex catalyzing histone 4 lysine 20 trimethylation (H4K20me3). RATIONALE: Based on its domain composition and on previously published data indicating its role as a methyltransferase, we sought to identify putative methylation substrates of SMYD5 in vitro. In addition, given that other members of the SMYD family, such as SMYD2 and SMYD3, have shown to play important roles in cancer promotion, including liver and colon cancer, we investigated the potential implication of SMYD5 in carcinogenesis using murine models and human samples. APPROACH: We performed an in vitro methylation assay using the recombinant human SMYD5 protein with histone and non-histone substrates. In addition, we generated Smyd5-deficient mice, in which the Smyd5 gene was inactivated either in all tissues (Smyd5flox / MX-Cre) or specifically in the liver (Smyd5flox /Alfp-Cre and Smyd5flox / Alb-Cre). Moreover, we produced intestine-specific Smyd5-deficient mice (Smyd5flox / Villin-Cre). Analysis of SMYD5 expression in human hepatocellular carcinoma (HCC) and colon cancer was conducted using The Human Cancer Genome Atlas (TCGA) datasets.RESULTS: We show that purified, baculovirus-expressed SMYD5 preferentially methylates histones 2A and 2B (H2A and H2B) in vitro. All four SMYD5 mouse knockout (KO) strains generated developed normally and did not display any visible phenotype. However, when subjected to a protocol of chemically induced carcinogenesis by diethylnitrosamine (DEN) injection, whole-tissue and liver Smyd5-deficient mice exhibited delayed liver tumor growth compared to wild-type (WT) mice exposed to the same treatment. The mice were subjected to macroscopic and histological analysis, including stainings to evaluate hepatic DNA damage and proliferation, as well as expression profiling by RNA-sequencing (RNA-seq) and by quantitative polymerase chain reaction (qPCR). A number of cancer- and proliferation-related genes showed reduced expression in the liver of Smyd5-deficient mice compared to WT mice.Analysis of Smyd5flox / Villin-Cre mice subjected to chemical treatment inducing colon carcinogenesis did not indicate any obvious phenotypic differences compared to WT mice receiving the same treatment. Consistent with the mice data, we found a significant correlation between SMYD5 expression and the incidence of hepatocellular cancer. SMYD5 expression in human liver tumor samples negatively correlated with overall patient survival and the probability of “tumor-free” survival after chemotherapy for a given time frame, but positively correlated with the probability of progressing to high-grade (G3/G4) tumors. Furthermore, based on mouse experiments and human colon cancer samples from TCGA, we concluded that SMYD5 does not seem to play a role in colon cancer, at least using the specific parameters of our analysis. CONCLUSIONS: We found that SMYD5 presents histone methyltransferase activity in vitro, with in vivo data from SMYD5 KO mouse models and human cancer samples supporting its role in liver carcinogenesis.

ΙΣΤΟΡΙΚΟ: Η πρωτεΐνη SMYD5 είναι μια μεθυλοτρανσφεράση των ιστονών που περιέχει τις δομικές περιοχές Su(Var)3-9, Enhancer-of-zeste και Trithorax (SET) και Myeloid, Nervy, και DEAF-1 (MYND) και η οποία αρχικά περιγράφηκε ως συστατικό του συμπλόκου πυρηνικού υποδοχέα (NCoR) που καταλύει την τριμεθυλίωση της λυσίνης 20 της ιστόνης 4 (H4K20me3). ΛΟΓΙΚΗ: Με βάση τη δομή και τα στοιχεία που έχουν δημοσιευτεί στο παρελθόν που δείχνουν το ρόλο της πρωτεΐνης SMYD5 ως μεθυλοτρανσφεράση, επιδιώξαμε να εντοπίσουμε εν δυνάμει υποστρώματα μεθυλίωσης του μορίου SMYD5 in vitro. Επιπλέον, δεδομένου ότι άλλα μέλη της οικογένειας SMYD, όπως η SMYD2 και η SMYD3 πρωτεΐνες, έχει δειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του ήπατος και του παχέος εντέρου, διερευνήσαμε την πιθανή επίπτωση του SMYD5 στην καρκινογένεση χρησιμοποιώντας μοντέλα ποντικών και ανθρώπινα δείγματα. ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ: Πραγματοποιήσαμε μια δοκιμασία in vitro μεθυλίωσης χρησιμοποιώντας την ανασυνδυασμένη ανθρώπινη πρωτεΐνη SMYD5 με υποστρώματα ιστονών και μη ιστονικά υποστρώματα. Επιπλέον, δημιουργήσαμε ανασυνδυασμένους ποντικούς με έλλειψη του Smyd5 γονιδίου, στους οποίους το γονίδιο Smyd5 απενεργοποιήθηκε είτε σε όλους τους ιστούς (Smyd5flox / MX-Cre) είτε συγκεκριμένα στο ήπαρ (Smyd5flox / Alfp-Cre and Smyd5flox / Alb-Cre). Επιπλέον, δημιουργήσαμε ποντίκια με έλλειψη Smyd5 ειδικά για το έντερο (Smyd5flox / Villin-Cre). Η ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου SMYD5 σε ανθρώπινο ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα (HCC) και καρκίνο του παχέος εντέρου πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα σύνολα δεδομένων The Human Cancer Genome Atlas (TCGA). ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Στην παρούσα μελέτη παρουσιάζουμε ότι η υπερεκφρασμένη με βακιλοϊό και καθαρισμένη SMYD5 πρωτεΐνη μεθυλιώνει, κατά προτίμηση, τις ιστόνες 2Α και 2Β (H2A και H2B) in vitro. Και τα τέσσερα στελέχη SMYD5 knockout (KO) ποντικών που δημιουργήθηκαν αναπτύχθηκαν κανονικά και δεν εμφάνισαν ορατό φαινότυπο. Ωστόσο, όταν υποβλήθηκε σε πρωτόκολλο χημικώς επαγόμενης καρκινογένεσης diethylnitrosamine (DEN), τα ποντίκια με πλήρη έλλειψη του γονιδίου Smyd5 από όλους τους ιστούς καθώς και μεμονωμένα στο ήπαρ, παρουσίασαν καθυστερημένη ανάπτυξη όγκου του ήπατος σε σύγκριση με ποντίκια άγριου τύπου (WT) που εκτέθηκαν στην ίδια θεραπεία. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε μακροσκοπική και ιστολογική ανάλυση, συμπεριλαμβανομένων των κηλίδων για την αξιολόγηση της ηπατικής βλάβης του DNA και του πολλαπλασιασμού, καθώς και σε ανάλυση του προτύπου έκφρασης του μεταγραφώματος με αλληλούχιση RNA (RNA-seq) και με ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφάσης (qPCR). Ορισμένα γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο και τον πολλαπλασιασμό έδειξαν μειωμένη έκφραση στο ήπαρ ποντικών με έλλειψη του Smyd5 γονιδίου σε σύγκριση με ποντίκια WT. Ανάλυση ποντικών Smyd5flox / Villin-Cre που υποβλήθηκαν σε χημική θεραπεία προκαλώντας καρκινογένεση του παχέος εντέρου δεν έδειξε εμφανείς φαινοτυπικές διαφορές σε σύγκριση με τα ποντίκια WT που έλαβαν την ίδια θεραπεία.Σύμφωνα με τα δεδομένα από την ανάλυση των ανασυνδυασμένων ποντικών, βρήκαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του SMYD5 και της επίπτωσης στον ηπατοκυτταρικό καρκίνο. Η έκφραση του SMYD5 γονιδίου σε δείγματα από όγκο ανθρώπινου ήπατος σχετίζεται αρνητικά με τη συνολική επιβίωση του ασθενούς και την πιθανότητα επιβίωσης “χωρίς όγκο” μετά από χημειοθεραπεία για ένα δεδομένο χρονικό πλαίσιο, αλλά σχετίζεται θετικά με την πιθανότητα προόδου σε όγκους υψηλού βαθμού (G3/G4). Επιπλέον, βάσει των πειραμάτων ποντικών και των δειγμάτων καρκίνου του παχέος εντέρου από την TCGA, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι το γονίδιο SMYD5 δεν φαίνεται να παίζει ρόλο στον καρκίνο του παχέος εντέρου, χρησιμοποιώντας τουλάχιστον τις συγκεκριμένες παραμέτρους της ανάλυσής μας. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διαπιστώσαμε ότι η πρωτεΐνη SMYD5 παρουσιάζει δραστικότητα μεθυλοτρανσφεράσης των ιστονών in vitro, με τα in vivo δεδομένα από μοντέλα SMYD5 KO ποντικών και δείγματα από καρκίνο στον άνθρωπο να υποστηρίζουν το ρόλο της και τη σημασία της στην καρκινογένεση του ήπατος.