Μοριακός έλεγχος της αποτελεσματικότητας αδρανοποίησης των στελεχών των Εντεροϊών Sabin 1 και Echo 12, χρησιμοποιώντας ένα ολοκληρωμένο σύστημα: κυτταροκαλλιέργειας/Real time RT-PCR και Real time RT-LAMP: επίπτωση της αδρανοποίησης στο ιικό γονιδίωμα

Abstract

Enteroviruses are members of Picornaviridae family, Enterovirus genus and are classified into class IV according to Baltimore classification system, since their genome consists of a positive sense single stranded RNA molecule. Enteroviruses are small, non-enveloped viruses, with an icosahedral protein capsid protecting their genetic material. Human Enteroviruses are classified into four groups: EV-A, EV-B, EV-C and EV-D and transmitted via fecal-oral route. They have been detected in clinical samples, so as well as in food and in the environment. The aim of the present PhD thesis was the molecular monitoring of thermal inactivation efficiency of Enteroviruses strains Sabin 1 and Echo 12, which belong to EV-C and EV-B respectively, and reveal the impact of thermal inactivation on the integrity of viral genome and the subsequent aptitude of Sabin 1 and Echo 12 to infect their hosts and complete successfully their replication cycle. The selection of two viral strains that belong to different groups of the same genus was intended in order to identify similarities and differences in their thermal inactivation process. At the initial part of the present study, we developed kinetics for each strain targeting firstly the positive strand in order to detect the Enterovirus genome and secondly the negative strand to detect their replicating activity and thus their capacity to successfully infect cell lines. For the detection of the negative strand, we designed a Stem-Loop Reverse Transcription Real-Time PCR assay that shows high sensitivity and specificity due to the thermodynamically stable form of the RT primer. Furthermore, the specific stem-loop primer used in Reverse Transcription assay was designed to target the 5’UTR of Enteroviruses which is a conserved region among Enterovirus genus. As a result, this molecular assay can be used to detect the negative strand in most Enterovirus strains. This assay allowed the detection of the negative strand (replicative strand) of Sabin 1 and Echo 12. Thus, we created one kinetic for replication activity of each strain in two virus concentrations, a high 10^6 CCID50 and a lower concentration 10 CCID50 in certain hours after the infection of a cell culture. Simultaneously, we created kinetics for the detection of the positive strand in certain hours after the infection of a cell culture. For the detection of the positive strand, we performed a conventional Real Time PCR assay by using the universal primer set ENV2/ENV1 which targets the 5’UTR of the positive strand of Enteroviruses. The results proved that both strains showed a similar pattern for the detection of their negative strand for both concentrations. For the 10^6 CCID50 concentration the negative strand was detected 4 hours post infection of the cell culture for both strains, while for the lower concentration the negative strand was detected 24 hours post infection of the cell culture. This practically means that an actively replicating Sabin 1 or Echo 12 strain concerning the 10^6 CCID50 concentration can be detected 4 hours post infection of the cell culture and 24 hours post infection of the cell culture concerning the 10 CCID50 concentration. These results compared with those which occurred from the CPE monitoring in a cell culture inoculation reveal that the Stem-Loop Reverse Transcription Real-Time PCR assay can detect the replicating activity of Enteroviruses faster than the cell culture. As for the positive strand, it was detected 2 hours post infection of the cell culture in the higher concentration, while for the lower concentration of Sabin 1 and Echo 12 strains it was detected 2 and 4 hours post infection respectively. The difference between the two strands is due to the fact that the positive strand exists in higher concentration levels (30-50 times) into the cells than the negative strand. Moreover, the kinetics that were developed concerning the lower concentration (10 CCID50) were implemented in 15 cerebrospinal fluid clinical samples (CSF), that were previously characterized as positive for Enteroviruses. In CSF, Enteroviruses exist in very low concentrations explaining why we decided to use the kinetics that were developed for the concentration of 10 CCID50. It revealed that actively replicating Enteroviruses were detected only in 5 out of 15 CSF samples, while in all samples their positive RNA genome was detected. The strains that were positively identified for both strands were subjected to molecular cloning and sequencing. The results showed that 3/5 were identified as Echovirus 30, 1/5 was identified as Coxsackievirus B3 and 1/5 as Coxsackievirus B5, proving that through the present molecular assay we can detect the negative RNA strand in the most strains of Enterovirus genus, as the stem loop RT primer was designed to target the 5’UTR of Enteroviruses. These kinetics can be used as a confirmatory method in order to test the effectiveness of inactivation of Enteroviruses in shorter time compared to cell cultures. In addition, they can be used in Enterovirus strains that cannot induce cytopathic effect in existing cell lines, such as some Coxsackievirus A strains. Subsequently, to the next part of the present study we identified the appropriate inactivation temperatures for the strains S1 and E12 that were used in two different concentrations, a high (10^6 CCID50) and a low (10 CCID50) by using an integrated system including cell culture and molecular assays. Moreover, we tested the impact of inactivation on viral genome targeting the most sensitive regions of viral genome (5’UTR, 3C, 3D and 3’UTR) for strand breaks. We determined that the most susceptible region to thermal inactivation is the 3’UTR, whereas the 5’UTR was determined as the most resistant. These results were also confirmed by calculating the GC content for both 5’UTR and 3’UTR regions. Furthermore, due to the importance of 5’UTR for Enterovirus detection, we decided to study this region more extensively in order to determine precisely the point of strand break after thermal processing at 82οC, which was identified as the appropriate inactivation temperature for both strains that were used. By this way, the break in this region was determined to be located near to the annealing site of the universal UC53 primer (position 588-606nt). The last goal of the present study was the development of an isothermal molecular assay (Real Time RT-LAMP) with high specificity and sensitivity for the detection of Enteroviruses, as an alternative approach in order to test the effectiveness of thermal inactivation of Enteroviruses targeting their 5’UTR region. Thus, we developed a Real Time RT-LAMP assay that can provide in one step (Reverse Transcription and amplification) the amplification of an RNA template under isothermal conditions in 60min. In this method 6 primers targeting the 5’UTR of Enteroviruses were designed and used. In the reaction mixture a specific Bst2.0 DNA polymerase with strand displacement activity and the WarmStartRTx Reverse Trancriptase were included. In the reaction mixture a fluorescent dye was included as well in order to provide results in real time during the reaction by measuring the fluorescence emission. The results validated that the present Real Time RT-LAMP assay can be used successfully in order to test the effectiveness of thermal inactivation of the strain Sabin 1 concerning the higher (10^6 CCID50) concentration, as they were in agreement with the results from the conventional Real Time PCR. Instead, for the Sabin 1 10 CCID50 it was proved that this method is inappropriate to test the effectiveness of thermal inactivation due to its sensitivity limit. During thermal processing the viral titer is reduced significantly and as a result it cannot be detected. In conclusion, for concentrations below 10 CCID50 the conventional Real Time PCR is the appropriate method in order to test the effectiveness of thermal inactivation. Same results occurred for the strain Echo 12 as well. Summarizing, we proved that thermal inactivation affects the integrity of Enterovirus genome as it causes breaks in many regions, with the 3’UTR identified to be the most sensitive region, whereas the 5’UTR determined as the most resistant in thermal inactivation. It was also revealed that there is a correlation between the integrity of viral genome and viral infectivity. So, in order to test the effectiveness of thermal inactivation it is essential to use an integrated system including cell culture for 2 or 3 passages combined with molecular assays testing for breaks on 3’UTR and 5’UTR and detecting the positive but mainly the negative strand of Enteroviruses, while the detection of their positive RNA does not reflect their ability to replicate and infect their hosts.

Οι Εντεροϊοί είναι μέλη της οικογένειας Picornaviridae του γένους Enterovirus και ταξινομούνται στην τάξη IV κατά Baltimore, καθώς το γονιδίωμα τους αποτελείται από ένα μονόκλωνο RNA θετικής πολικότητας. Πρόκειται για μικρούς μη ελυτροφόρους ιούς, που διαθέτουν ένα εικοσαεδρικό πρωτεϊνικό καψίδιο που προστατεύει το γενετικό τους υλικό. Οι Εντεροϊοί που προσβάλλουν τον άνθρωπο ανήκουν σε τέσσερεις ομάδες: EV-A, EV-B, EV-C και EV-D και μεταδίδονται μέσω της κοπρανο-στοματικής οδού. Εντοπίζονται σε κλινικά δείγματα, τρόφιμα και στο περιβάλλον. Στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μοριακή μελέτη της θερμικής αδρανοποίησης των στελεχών Sabin 1 και Echo 12 που ανήκουν στις ομάδες C και B αντίστοιχα, καθώς και της επίπτωσης της θερμικής αδρανοποίησης στο ιικό γονιδίωμα και κατά συνέπεια στην ικανότητα των ιών αυτών να μολύνουν κύτταρα και να ολοκληρώνουν επιτυχώς τον κύκλο ζωής τους. Η επιλογή δύο διαφορετικών ιικών στελεχών που ανήκουν σε διαφορετικές ομάδες του ίδιου γένους έγινε με σκοπό τη σύγκριση των αποτελεσμάτων και τον εντοπισμό ομοιοτήτων, αλλά και διαφορών όσον αφορά την αδρανοποίηση τους μέσω θέρμανσης. Στο πρώτο στάδιο της διατριβής δημιουργήθηκαν κινητικές μελέτες για το κάθε στέλεχος στοχεύοντας 1ον το θετικό κλώνο για την ανίχνευση του γονιδιώματος τους, και κατά 2ον τον αρνητικό κλώνο για την ανίχνευση της αντιγραφικής ενεργότητας τους και κατά συνέπεια της ικανότητάς τους να μολύνουν επιτυχώς κυτταρικές σειρές. Για την ανίχνευση του αρνητικού κλώνου σχεδιάστηκε μία ειδική Stem-loop Reverse Transcription Real-Time PCR, η οποία παρουσιάζει μεγάλη ευαισθησία και εξειδίκευση χάρη στη θερμοδυναμικά σταθερή δομή του εκκινητή που χρησιμοποιείται κατά τη διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής (RT). Ο ειδικός stem-loop εκκινητής της RT σχεδιάσθηκε ώστε να στοχεύει τμήμα της 5’UTR των Εντεροϊών, η οποία είναι μια σχετικά συντηρημένη περιοχή ανάμεσα στο γένος των Εντεροϊών και μέσω αυτής της μοριακής τεχνικής είναι δυνατή η ανίχνευση του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου στους περισσότερους ιούς του γένους των Εντεροϊών. Η τεχνική αυτή επέτρεψε την ανίχνευση του κλώνου αρνητικής πολικότητας (αντιγραφόμενος κλώνος) των στελεχών Sabin 1 και Echo 12 και δημιουργήθηκαν κινητικές μελέτες για τον έλεγχο της αντιγραφικής ενεργότητας των δύο στελεχών σε 2 συγκεντρώσεις, μία υψηλή της τάξης των 10^6 CCID50 και μία χαμηλή της τάξης των 10 CCID50 σε συγκεκριμένες ώρες μετά τη μόλυνση της κυτταροκαλλιέργειας. Παράλληλα δημιουργήθηκαν και κινητικές μελέτες για την ανίχνευση του θετικού κλώνου μέσα στα κύτταρα σε συγκεκριμένες ώρες μετά τη μόλυνση της κυτταροκαλλιέργειας. Για την ανίχνευση του θετικού κλώνου, η διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν Real-Time PCR με το universal εκκινητικό ζεύγος ENV2/ENV1 που στοχεύει στην 5’UTR περιοχή του θετικού κλώνου των Εντεροϊών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι και τα δύο στελέχη εμφάνισαν παρόμοιο πρότυπο ανίχνευσης για τον αρνητικό κλώνο και για τις δύο συγκεντρώσεις. Για τη συγκέντρωση 10^6 CCID50 και για τα δύο στελέχη, ο αρνητικός κλώνος εντοπίστηκε 4 ώρες μετά τη μόλυνση της κυτταροκαλλιέργειας, ενώ αντίστοιχα για τη χαμηλότερη συγκέντρωση ο αρνητικός κλώνος ανιχνεύθηκε 24 ώρες μετά τη μόλυνση της κυτταροκαλλιέργειας. Αυτό πρακτικά σημαίνει πως ένα αντιγραφικά ενεργό στέλεχος S1 ή Ε12 σε συγκέντρωση 10^6 CCID50 μπορεί να ανιχνευθεί σε 4 ώρες μετά τη μόλυνση της κυτταρικής σειράς, ενώ σε συγκέντρωση 10 CCID50 μέσα σε 24 ώρες μετά τη μόλυνση. Τα αποτελέσματα αυτά συγκριτικά με την εμφάνιση κυτταρικών αλλοιώσεων σε κυτταρικές σειρές αποδεικνύουν ότι η τεχνική Stem-Loop Reverse Transcription Real-Time PCR εντοπίζει την αντιγραφική ενεργότητα των Εντεροϊών σε πολύ μικρότερο χρονικό διάστημα από ότι η κυτταροκαλλιέργεια. Όσον αφορά το θετικό κλώνο, αυτός ανιχνεύθηκε και για τα δύο στελέχη στην υψηλή συγκέντρωση 2 ώρες μετά τη μόλυνση της κυτταροκαλλιέργειας, ενώ για τη χαμηλή συγκέντρωση των στελεχών S1 και Ε12 εντοπίζεται 2 και 4 ώρες αντίστοιχα. Η παρατηρούμενη αυτή διαφορά ανάμεσα στους δύο κλώνους οφείλεται στο γεγονός ότι ο θετικός κλώνος βρίσκεται σε μεγαλύτερη συγκέντρωση (30-50 φορές) από ότι ο αρνητικός μέσα στα κύτταρα. Επιπλέον οι κινητικές μελέτες που αναπτύχθηκαν για τη χαμηλότερη συγκέντρωση 10 CCID50 εφαρμόστηκαν και σε 15 κλινικά δείγματα εγκεφαλονωτιαίου υγρού (ΕΝΥ) τα οποία είχαν ήδη χαρακτηριστεί θετικά για την ύπαρξη Εντεροϊού. Αυτή η επιλογή έγινε καθώς στο ΕΝΥ οι Εντεροϊοί βρίσκονται σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις. Αποδείχτηκε πως μόνο σε 5 από το σύνολο των 15 κλινικών δειγμάτων ανιχνεύθηκαν αντιγραφικά ενεργοί Εντεροϊοί, ενώ σε όλα τα δείγματα ανιχνεύθηκε το γονιδίωμα του θετικού κλώνου. Τα στελέχη τα οποία βρέθηκαν θετικά και για τους δύο κλώνους κλωνοποιήθηκαν και αλληλουχήθηκαν. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως 3/5 ταυτοποιήθηκαν ως ιοί Echovirus 30, 1/5 ταυτοποιήθηκε ως ιός Coxsackievirus B3 και 1/5 ως ιός Coxsackievirus B5, αποδεικνύοντας πως μέσω της παρούσας μοριακής τεχνικής, είναι δυνατή η ανίχνευση του αρνητικής πολικότητας RNA κλώνου στους περισσότερους ιούς του γένους των Εντεροϊών, αφού ο σχεδιασμός του ειδικού stem-loop εκκινητή της RT έγινε στοχεύοντας τμήμα της 5’UTR των Εντεροϊών. Οι συγκεκριμένες κινητικές μελέτες μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν ως επιβεβαιωτική μέθοδος για την εξακρίβωση της επιτυχούς αδρανοποίησης διαφόρων στελεχών των Εντεροϊών, κερδίζοντας αρκετό χρόνο συγκριτικά με τις κυτταροκαλλιέργειες. Ακόμη, βρίσκουν εφαρμογή σε στελέχη Εντεροϊών τα οποία δεν προκαλούν κυτταρικές αλλοιώσεις σε υπάρχουσες κυτταρικές σειρές, όπως για παράδειγμα ορισμένα στελέχη ιών Coxsackie A. Στο επόμενο στάδιο, εντοπίστηκαν οι κατάλληλες θερμοκρασίες που απαιτούνται για την αδρανοποίηση των στελεχών S1 και E12 σε μία πολύ υψηλή (10^6 CCID50) και μία χαμηλή συγκέντρωση (10 CCID50) χρησιμοποιώντας μοριακές τεχνικές παράλληλα με τη χρήση κυτταροκαλλιεργειών. Ακολούθησε διερεύνηση της επίπτωσης της θερμικής επεξεργασίας στο γονιδίωμα των ιών για πρόκληση ρήξεων, στοχεύοντας τις γενωμικές περιοχές (5’UTR, 3C, 3D και 3’UTR) όπου διαπιστώθηκε πως η πιο ευαίσθητη περιοχή στη θέρμανση είναι η 3’UTR, σε αντίθεση με την 5’UTR που εντοπίστηκε ως η πιο ανθεκτική Ακολούθως, λόγω της σημασίας της περιοχής 5’UTR για την ανίχνευση των Εντεροϊών, η περιοχή αυτή μελετήθηκε πιο εκτεταμένα όσον αφορά το σημείο πρόκλησης θραύσης μετά από θέρμανση στη θερμοκρασία των 82οC, που προσδιορίστηκε ως η κατάλληλη θερμοκρασία για την πλήρη αδρανοποίηση των στελεχών που χρησιμοποιήθηκαν όταν η συγκέντρωσή τους ήταν ιδιαίτερα υψηλή (10^6 CCID50). Έτσι, προσδιορίστηκε πως η ρήξη στη συγκεκριμένη περιοχή δημιουργείται κοντά στη θέση πρόσδεσης του universal εκκινητή UC53 (θέση 588-606nt) πάνω στην αλληλουχία της 5’UTR. Τα αποτελέσματα επαληθεύτηκαν ελέγχοντας επιπλέον την περιεκτικότητα σε GC των δύο αυτών περιοχών. Επόμενος στόχος ήταν η ανάπτυξη μιας ευαίσθητης, ειδικής , ισοθερμικής μοριακής τεχνικής ανίχνευσης των Εντεροϊών της Real Time RT-LAMP ως εναλλακτικός τρόπος επιβεβαίωσης της θερμικής αδρανοποίησης στοχεύοντας την 5’UTR. Έτσι, αναπτύχθηκε η Real Time RT-LAMP, ώστε να παρέχει σε ένα στάδιο (αντίστροφης μεταγραφής και πολλαπλασιασμού του στόχου) σε ισοθερμικές συνθήκες την ενίσχυση του RNA στόχου εντός 60 min. Σε αυτή τη μέθοδο σχεδιάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν 6 εκκινητές σχεδιασμένοι να στοχεύουν την 5’UTR των Εντεροϊών. Στο μίγμα της αντίδρασης εμπεριέχεται η ειδική DNA πολυμεράση με ενεργότητα εκτόπισης κλώνου Bst 2.0 και η αντίστροφη μεταγραφάση WarmStartRTx . Περιέχεται επίσης και μία φθορίζουσα χρωστική η SYBR Green, ώστε να καθίσταται δυνατή η μέτρηση του φθορισμού σε πραγματικό χρόνο κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Από τα αποτελέσματα που προέκυψαν, αποδείχτηκε ότι η Real Time RT-LAMP που αναπτύχθηκε στην παρούσα διατριβή μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά για τον έλεγχο της επιτυχίας της αδρανοποίησης όσον αφορά το ιικό στέλεχος Sabin 1 συγκέντρωσης 10^6 CCID50, καθώς έδωσε τα ίδια αποτελέσματα με αυτά της απλής της Real Time RT-PCR. Αντίθετα, όσον αφορά το πρότυπο εμβολιακό στέλεχος Sabin 1 συγκέντρωσης 10 CCID50, αποδείχτηκε ότι η συγκεκριμένη μέθοδος δεν μπορεί να εφαρμοστεί λόγω του ορίου της ευαισθησίας της καθώς μετά τη θερμική επεξεργασία ο ιικός τίτλος μειώνεται με αποτέλεσμα η συγκέντρωση του ιού να ελαττώνεται σημαντικά και να μην ανιχνεύεται. Συμπεραίνεται λοιπόν ότι για τις συγκεντρώσεις κάτω των 10 CCID50 η συμβατική Real Time RT-PCR είναι καταλληλότερη για τη μελέτη της θερμικής αδρανοποίησης. Ανάλογα ήταν και τα αποτελέσματα για το στέλεχος Ε12. Συνοψίζοντας, προσδιορίστηκε ότι η θερμική αδρανοποίηση επηρεάζει την ακεραιότητα του γονιδιώματος των Εντεροϊών, καθώς οδηγεί στη δημιουργία ρήξεων σε πολλές περιοχές του γονιδιώματός του, με την 3’UTR να ανιχνεύεται ως η πλέον ευαίσθητη και η 5΄UTR περιοχή ως η πλέον ανθεκτική στη θερμική αδρανοποίηση. Αποδείχθηκε επίσης, ότι υπάρχει άμεση συσχέτιση της ακεραιότητας του γονιδιώματος και της ιικής μολυσματικότητας και πως για τον έλεγχο της αποτελεσματικότητας της θερμικής αδρανοποίησης είναι απαραίτητος ένας πλήρης έλεγχος ο οποίος περιλαμβάνει 2-3 ανακαλλιέργειες του ιού σε ευαίσθητη κυτταρική σειρά σε συνδυασμό με την ανίχνευση ρήξεων τουλάχιστον στην 3’UTR και στην 5΄UTR, και τέλος την ανίχνευση του θετικού αλλά κυρίως αρνητικού κλώνου των Εντεροϊών στην 5΄UTR γενωμική περιοχή καθώς η ανίχνευση του θετικού κλώνου του RNA του γονιδιώματος των Εντεροϊών δεν αποτελεί ένδειξη ενός ενεργά αντιγραφικού ιού και κατά συνέπεια μολυσματικού ιού.