Μεταβολομική ανάλυση τυροκομικών προϊόντων με την φασματοσκοπία NMR

Abstract

This dissertation deals with the study of PDO Cretan graviera cheese and several white PDO Cretan cheeses produced solely on the island, using high field and low field (LF) NMR spectroscopy and metabolomics for the development of multivariate statistical analysis models based on the NMR experimental data. The research results are presented in three main parts; the first deals with the study of the maturation process of Cretan graviera cheese, the second part examines the effect of milk composition and state (liquid or powder) on the chemical composition of graviera, while the third part deals with the analysis of several sour white PDO cheeses produced in Crete. Three (3) Cretan graviera samples produced in different dairy producer sites on the island of Crete were studied in the first part of the thesis, were followed during maturation, and sampled regularly for analysis. Polar and apolar extracts of the graviera cheese samples were studied by high resolution NMR spectroscopy, and the integration of the NMR spectra was used for the quantitative determination of the chemical composition (metabolite) profile of the graviera samples as a function of the maturation time. The analytical results were used to calculate the rate of proteolysis (aminoacid production, μmol/d), lipolysis (1,2-Diglycerides/Triglycerides ratio) and tyramine (μmol/d) production for each of the three different graviera samples studied under maturation. Furthermore, multivariate statistical analysis PLS models based on the NMR data were developed in order to elucidate important metabolites correlated with maturation, and to identify possible differences in the maturation procedure in different dairy production facilities. These PLS models were applied to the compositional analysis of a large set of commercial graviera samples in an effort to assess the potential of NMR metabolomics in the determination of the maturation time of unknown samples.One of the graviera samples, obtained from Kargakis dairy farm, was used to monitor the maturation procedure by performing low field NMR experiments in the same samples and time frame as the high resolution NMR analysis. The parameters measured in these experiments were the T1 and T2 relaxation times and diffusion coefficients D of the water and lipid protons as a function of maturation time, and the proton relaxation rate as a function of magnetic field strength obtained from Fast Field Cycling (FFC) NMR experiments. The proton T1 and T2 relaxation times of water and lipid fat in the graviera were found to be similar in value to other yellow hard and semi-hard cheeses reported in the literature, and did not change much with maturation time. The diffusion coefficient of fat, Df, displayed a small increase as a function of maturation time, while the diffusion coefficient of water Dw decreased with maturation time. A comparison of the PLS maturation models developed showed that the multivariate model incorporating both low and high field NMR data demonstrated better validation and statistical significance characteristics compared to models using either just the low or only the high field NMR data.The second part of the thesis involved the laboratory production of five different “model” sheep cheeses based on the cheese-making protocol used for Cretan graviera, in order to study the effect of milk quality (sheep milk – commercial sheep milk powder) on the composition and quality attributes of the graviera samples. The milk used was either 100% sheep milk obtained from a dairy farm, or a mixture of such milk with increasing amounts of commercial sheep milk powder (25-100%). After the production of the model graviera cheeses they were left to mature for 90 days, as per PDO directions, during which they were sampled for extraction and NMR spectral analysis. This series of experiments showed that all cheeses prepared with some amount of milk powder contained 1-monoglycerides (1-MG) the quantity of which was increasing with % milk powder used and maturation time and were low in amino acids and lactate. NMR analysis of the commercial milk powder identified 1-MG as preexisting components of the lipid matrix which were transferred to the graviera cheese during the cheese-making procedure. Retroanalysis of NMR spectra of a large number of commercial graviera samples revealed the presence of 1-MG in a small number of samples, indicating either the (illegal in case of PDO products) use of milk powder, or the suboptimal practices in milk treatment before cheese-making.The third part of the thesis deals with the qualitative and quantitative high resolution NMR analysis of different types of “sour” Cretan PDO white cheeses, namely Xynomizithra Kritis, Xygalo Sitias, Piktogalo Chanion and xynogalo (non PDO). The water extract of these cheeses was found to contain sugars, organic acids, amino acids, alcohols and nitrogen compounds, all of which were successfully quantified using NMR spectroscopy, and the same was done for the apolar lipid extract of the cheeses. It was found that the polar metabolite profile of the cheeses showed the greater variability, while the lipid fraction only showed minor differences. The obtained 1H NMR metabolite profiles of the white Cretan cheeses were used to construct multivariate statistical analysis models that classified the type and production method of the different white “sour” cheeses. It was also shown that PDO Xinomizithra Kritis could not be differentiated according to geographical origin within the general area of production on the island of Crete.

H παρούσα διατριβή αφορά τη μελέτη της γραβιέρας Κρήτης ΠΟΠ και κρητικών λευκών όξινων τυριών ΠΟΠ με τη χρήση της Φασματοσκοπίας NMR χαμηλού και υψηλού πεδίου και την μεταβολομική ανάλυση των πειραματικών δεδομένων με κατάλληλα πολυπαραμετρικά στατιστικά μοντέλα Η διατριβή χωρίζεται σε τρία κύρια μέρη, το πρώτο αφορά τη μελέτη της διαδικασίας ωρίμανσης της γραβιέρας Κρήτης, το δεύτερο τη μελέτη της επίδρασης του γάλακτος τυροκόμησης στα ποιοτικά χαρακτηριστικά της γραβιέρας Κρήτης, και το τρίτο την ανάλυση τεσσάρων διαφορετικών τύπων λευκών όξινων τυριών με ΠΟΠ (πλην ενός) που παράγονται στην Κρήτη. Στο πρώτο μέρος της διατριβής μελετήθηκαν τρία (3) δείγματα κρητικής γραβιέρας που παράχθηκαν σε τυροκομεία της ευρύτερης περιοχής της Κρήτης και κατά τη διάρκεια της ωρίμανσής τους έγιναν τακτικές δειγματοληψίες για ανάλυση. Με τη χρήση της φασματοσκοπίας NMR υψηλής ανάλυσης λήφθηκαν τα φάσματα των υδατικών και άπολων εκχυλισμάτων των δειγμάτων γραβιέρας, και με την ποσοτική ολοκλήρωση των φασμάτων NMR προσδιορίστηκε η χημική σύσταση και οι μεταβολές στη συγκέντρωση των ενώσεων (μεταβολιτών) της γραβιέρας με την αύξηση του χρόνου ωρίμανσης. Με βάση αυτά τα ποσοτικά αναλυτικά δεδομένα υπολογίστηκαν οι ρυθμοί πρωτεόλυσης (παραγωγή μmol αμινοξέων/ημέρα) και λιπόλυσης (αύξηση λόγου 1,2-διγλυκεριδία/τριγλυκερίδια), καθώς και ο ρυθμός παραγωγής της τυραμίνης (παραγωγή μmol τυραμίνης/ημέρα) για κάθε δείγμα. Χρησιμοποιώντας τα ποσοτικά δεδομένα που προέκυψαν από τα φάσματα 1H NMR, αναπτύχθηκαν πολυπαραμετρικά στατιστικά μοντέλα PLS (Partial Least Squares) και προσδιορίστηκαν οι πιο σημαντικοί μεταβολίτες που συσχετίζονται με την εξέλιξη της διαδικασίας ωρίμανσης, καθώς και οι διαφορές και οι ομοιότητες στη διαδικασία ωρίμανσης για κάθε γραβιέρα ανάλογα με το τυροκομείο προέλευσης. Τα αποτελέσματα των μεταβολομικών μοντέλων PLS για την ωρίμανση της γραβιέρας Κρήτης εφαρμόστηκαν στην ανάλυση της σύστασης ενός μεγάλου αριθμού δειγμάτων γραβιέρας του εμπορίου σε μια προσπάθεια να εκτιμηθεί η δυνατότητα της μεταβολομικής ανάλυσης NMR στον χαρακτηρισμό του χρόνου ωρίμανσης αγνώστων δειγμάτων. Ένα από τα δείγματα γραβιέρας Κρήτης, που προερχόταν από το τυροκομείο Καργάκη, χρησιμοποιήθηκε για την πραγματοποίηση πειραμάτων μελέτης της διαδικασίας ωρίμανσης με τεχνικές ανάλυσης NMR χαμηλού πεδίου, στα πλαίσια των οποίων προσδιορίστηκαν οι χρόνοι αποδιέγερσης T1 και T2 και οι συντελεστές διάχυσης των πρωτονίων του νερού και των λιπαρών της γραβιέρας συναρτήσει του χρόνου ωρίμανσης, καθώς και ο ρυθμός αποδιέγερσης των πρωτονίων συναρτήσει της συχνότητας του μαγνητικού πεδίου με τη μέθοδο Fast field cycling (FFC). Βρέθηκε ότι οι χρόνοι Τ1 των πρωτονίων του νερού και των λιπαρών της γραβιέρας έχουν παρόμοιες τιμές με άλλα κίτρινα σκληρά τυριά που αναφέρονται στη βιβλιογραφία. Οι χρόνοι αποδιέγερσης T2w και Τ2f και οι συντελεστές διάχυσης Dw και Df της γραβιέρας επίσης βρέθηκαν να έχουν τιμές αντίστοιχες με άλλα γνωστά ημίσκληρα κίτρινα τυριά διαφορετικής προέλευσης. Βρέθηκε τέλος ότι ο συντελεστής διάχυσης των λιπαρών Df της γραβιέρας αυξάνεται ελαφρά κατά την ωρίμανση, ενώ αυτός του νερού, Dw μειώνεται. Από τα μοντέλα PLS που αναπτύχθηκαν για την ωρίμανση της γραβιέρας βρέθηκε ότι αυτό με τα καλύτερα χαρακτηριστικά όσον αφορά τη στατιστική σημαντικότητα (παράμετρος p) ήταν αυτό που περιείχε το σύνολο των πειραματικών δεδομένων από μετρήσεις NMR τόσο σε χαμηλό όσο και σε υψηλό πεδίο. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής παρήχθησαν πέντε (5) διαφορετικά δείγματα πρόβειου τυρού στο εργαστήριο ακολουθώντας τη διαδικασία τυροκόμησης της γραβιέρας για να μελετηθεί η επίδραση της ποιότητας του γάλακτος (γάλα πρόβειο - γάλα σκόνη) στη σύσταση και τα ποιοτικά χαρακτηριστικά της γραβιέρας. Το γάλα που χρησιμοποιήθηκε ήταν είτε 100% πρόβειο ή μείγμα αυτού με σκόνη πρόβειου γάλακτος με αυξανόμενο ποσοστό γάλακτος σκόνης (25-100 %). Μετά τη διαδικασία της πρότυπης τυροκόμησης τα δείγματα παρέμειναν προς ωρίμανση για 90 ημέρες, κατά τη διάρκεια των οποίων πραγματοποιήθηκαν τακτικές δειγματοληψίες τις ημέρες 1, 13, 27, 60, 90. Από την ανάλυση των φασμάτων ΝΜR της σειράς αυτής δειγμάτων ταυτοποιήθηκε η παρουσία 1-μονογλυκεριδίων (1-MG) σε όλα τα δείγματα που τυροκομήθηκαν με τη χρήση σκόνης γάλακτος. Η ποσότητα των 1-MG αυξάνονταν με το ποσοστό γάλακτος-σκόνης που είχε χρησιμοποιηθεί, και με το χρόνο ωρίμανσης των δειγμάτων γραβιέρας. Η ανάλυση NMR του πρόβειου γάλακτος σε σκόνη έδειξε ότι τα 1-MG προϋπήρχαν σε αυτό και μεταφέρθηκαν στη γραβιέρα κατά τη διαδικασία της τυροκόμησης. H ρετροανάλυση δειγμάτων γραβιέρας του εμπορίου έδειξε την παρουσία 1-μονογλυκεριδίων σε μερικά εξ αυτών, υποδεικνύοντας είτε την πιθανή χρήση γάλακτος σκόνης κατά την τυροκόμηση, είτε τη χρήση κακών πρακτικών κατά το χειρισμό του γάλακτος.Στο τρίτο μέρος της διατριβής μελετήθηκαν με Φασματοσκοπία NMR υψηλής ανάλυσης δείγματα κρητικών όξινων τυριών τόσο ποιοτικά όσο και ποσοτικά, και συγκεκριμένα ξινομυζήθρα (ΠΟΠ και μη), ξύγαλο (ΠΟΠ και μη), ξινόγαλο και πηχτόγαλο (ΠΟΠ). Στο υδατικό εκχύλισμα των όξινων τυριών προσδιορίστηκαν ποσοτικά σάκχαρα, μικρά οργανικά οξέα, αμινοξέα, αλκοόλες, αζωτούχες και άλλες χημικές ενώσεις. Βρέθηκε ότι τα όξινα κρητικά τυριά διαφοροποιούνται κυρίως ως προς το πολικό μεταβολομικό προφίλ τους, ενώ μικρές διαφορές μόνο παρουσιάστηκαν στο λιπιδικό προφίλ. Με βάση τα ποσοτικά δεδομένα από την ολοκλήρωση φασμάτων 1H NMR αναπτύχθηκαν μεταβολομικά μοντέλα ανάλυσης για τον επιτυχή διαχωρισμό του τύπου και της διαδικασίας παραγωγής των λευκών όξινων τυριών με βάση τη χημική τους σύσταση. Όσον αφορά την ξυνομυζήθρα ΠΟΠ Κρήτης, δε βρέθηκαν σημαντικές διαφορές σε σχέση με τη γεωγραφική προέλευση των δειγμάτων.