Τρόπος δράσης και θεραπευτικό όφελος της ενδοϋαλοειδικής χορήγησης μεσεγχυματικών κυττάρων λιπώδους ιστού και νανοφορέων anti-VEGF σε επαγόμενο ζωικό μοντέλο φλεβικής απόφραξης του αμφιβληστροειδούς

Abstract

In recent years, anti-angiogenic therapeutic agents (anti-VEGF) have contributed to the treatment of retinal vein occlusion (RVO) while polymeric nanocarriers for sustained-release ophthalmic drug delivery are emerged rapidly. At the same time, Mesenchymal Stromal Cells-mediated therapies (MSCs) are associated with secretory agents that protect the ganglion cells, limiting eye degeneration. The MEK kinase inhibitor, PD0325901, has been applied to induce RVO following intravitreal administration to rabbits. The aim of the present study is to determine the effect of adipose derived-MSCs (ASCs) combination with nanocarriers of anti-VEGF in a PD0325901-mediated induced animal model of RVO.In an in vitro approach, MEK kinase inhibitor-PD0325901 was used to induce the expression of EPCR (Endothelial Protein C Receptor), a common related to RVO marker, on HUVEC (Human Umbilical Cord Endothelial Cell) culture. Anti-VEGF encapsulated in thiolated chitosan (ThioCHI) nanoparticles, MSCs and a combination of these was applied to the cultures and their effect was monitored. Net nanoparticles of CHI and ThioCHI were prepared by ionic gelation technique while ThioCHI was selected as polymeric matrix for anti-VEGF encapsulation. Their full characterization was followed using Fourier-transform infrared spectroscopy, Differential scanning calorimetry and X-ray diffraction. MSCs were prepared from human adipose tissue liposuction cultured up to five passages. Following 24-hour exposure of HUVEC to PD0325901, the effect of anti-VEGF nanoparticles, MSCs, and a combination of these was assessed by quantifying the secreted EPCR and time-controlled anti-VEGF release. For in vivo experiments, ASCs were isolated from rabbits, expanded and characterized while they genetically modified to secrete the green fluorescence GFP. Twenty-four New Zealand rabbits were divided into the four following groups: Group I ASCs (n = 6), group II ASCs + nanoThioCHI-anti-VEGF (n = 6), group III RVO (n = 6) and group IV control (n = 6). For the RVO induction groups I-III received intravitreal (iv) injections of PD0325901 at a dose volume of 0.1 mL/eye while the control group received BSS only. Twelve days later therapeutic regiments were administered at groups I-II while groups III-IV received BSS. Two weeks later the animals were sacrificed to determine the therapeutic efficacy of all the administered regimens. The retinal lesions were evaluated via detailed ophthalmic examinations, histological analysis of fixed retinal sections, ELISA for secreted cytokines in peripheral blood or vitreous fluid and Q-PCR for the expression of related to the occlusion and inflammatory genes. Very small embryonic like stem cells (VSELs) isolated from animals peripheral blood, as a response to the induced damage, 12 and 36 days after the induction and characterized with alkaline phosphatase staining as well as real-time PCR for the expression of embryonic genes. The modified prepared nanoparticles showed no cytotoxic effect while antibody release was constant for 8 days. The abnormal EPCR levels were statistically significantly reduced after 24- and 48-hours following exposure of the abnormal endothelium either to the anti-VEGF nanoparticles or to MSCs. A combination of both agents was more effective than either agent separately on 24 hours in vitro, followed by simultaneous reduction on VEGF translation levels of abnormal endothelium. Mild retinal edema and hemorrhages, limited retinal detachment and vasculature attenuation were observed in Groups I and II compared with the pathological symptoms of Group III which presented a totally disorganized retinal structure, following of positive immunostaining for neovascularization (FVIII) and related to RVO markers. Important reduction of the high secreted levels of inflammatory cytokines were quantified in Groups I and II vitreous fluid, while the expression of the RVO-related and inflammatory genes has been significantly decreased especially in group II. Positive immunostaining was observed for tissue regeneration markers (ki-67, GFAP) in groups which received one of the proposed therapies. GFP+ ASCs, capable of being differentiated towards neural progenitors, detected in dissociated retina tissues of group II presenting their attachment to damaged area. H&E staining of cell smears revealed very small sized cells with high nucleo-cytoplasmic ratio in RVO-induced animal group only. The positive alkaline phosphatase staining, in combination with the overexpression of the Oct3/4, Nanog and Sox-2 transcription factors confirmed the existence of undifferentiated cells with embryonic like features as a response to damage. A stem cell-based therapy for RVO is proposed, accompanied by sustained and time-controlled release of anti-VEGF, in order to combine the paracrine action of ASCs and the progressive reduction of neovascularization.

Τα τελευταία χρόνια, η χρήση αντι-αγγειογενετικών παραγόντων (anti-VEGF) έχει συμβάλλει ενεργά στη θεραπεία της απόφραξης φλέβας του αμφιβληστροειδούς (RVO) την ίδια στιγμή που πολυμερικοί νανοφορείς για ελεγχόμενη και διαρκή αποδέσμευση του φαρμάκου αναδύονται ταχύτατα. Παράλληλα τα μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα (MSCs) και οι εκκρινόμενοι από αυτά παράγοντες έχουν συσχετιστεί με την προστασία των γαγγλιακών κυττάρων, περιορίζοντας τηνν εκφύλιση. Ο αναστολέας κινάσης ΜΕΚ, PD0325901, έχει εφαρμοστεί για επαγόμενη ανάπτυξη RVO μετά από ενδοϋαλοειδική χορήγηση σε κονίκλους. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι να προσδιοριστεί το αποτέλεσμα της συνδυαστικής επίδρασης MSCs προερχόμενων από το λιπώδη ιστό (ASCs) και νανοφορέων anti-VEGF με βελτιωμένες ιδιότητες σε ένα PD0325901 φαρμακευτικά επαγόμενο μοντέλο RVO. Στην in vitro προσέγγιση της μελέτης, ο αναστολέας PD0325901 χρησιμοποιήθηκε για να επάγει την έκφραση EPCR (Endothelial Protein C Receptor), ενός κοινού για την RVO δείκτη, σε πρωτογενή σειρά ενδοθηλίου HUVEC (Human Umbilical Cord Endothelial Cell). Αντίσωμα anti-VEGF ενθυλακώθηκε σε νανοσωματίδια τροποποιημένης θειολωμένης χιτοζάνης (ThioCHI) και συνδυαστικά με MSCs εφαρμόστηκαν σε καλλιέργειες προσομοίωσης RVO προς έλεγχο της απόκρισής τους στον συνδυασμό. Σκέτα νανοσωματίδια CHI και ThioCHI κατασκευάστηκαν με την τεχνική της ιονικής πηκτωματοποίησης και τα ThioCHI επιλέχτηκαν ως πολυμερική μήτρα βελτιωμένων ιδιοτήτων βιοπροσκόλλησης για την ενθυλάκωση του anti-VEGF. Πλήρης χαρακτηρισμός των παρακευασθέντων NPs έγινε με φασματοσκοπία υπερύθρου, περίθλαση ακτίνων Χ και SEM. Τα MSCs λήφθηκαν κατόπιν ενζυμικής λύσης ανθρώπινου λιπώδους ιστού που λήφθηκε κατόπιν λιπεκτομής και καλλιεργήθηκε μέχρι και το στάδιο των 5 ανακαλλιεργειών το πολύ. Μετά από έκθεση 24 ωρών της σειράς HUVEC στον αναστολέα PD0325901, η επίδραση των NPs με ενθυλακωμένο anti-VEGF(nanoThioCHI-anti-VEGF), MSCs και συνδυασμού τους αξιολογήθηκε με ποσοτικοποίηση των εκκρινόμενων ποσοτήτων EPCR και anti-VEGF σε βάθος χρόνου με δοκιμασίες ELISA.Για τις in vivo πειραματικές δοκιμές, ASCs απομονώθηκαν κατόπιν ενζυμικής λύσης λιπώδους ιστού που λήφθηκε από τη βουβωνική χώρα κονίκλου. Τα κύτταρα εκπτύχθηκαν, χαρακτηρίστηκαν και τροποποιήθηκαν γενετικά προκειμένου να εκφράζουν την πράσινη φθορίζουσα χρωστική GFP. Εικοσι-τέσσερις κόνικλοι Νέας Ζηλανδίας χωρίστηκαν στις ακόλουθες τέσσερις ομάδες: Ομάδα Ι ASCs (n = 6), ομάδα ΙΙ ASCs + nanoThioCHI-anti-VEGF (n = 6), ομάδα III RVO (n = 6) και ομάδα IV ελέγχου (n = 6). Για την επαγωγή RVO οι ομάδες Ι-ΙΙΙ έλαβαν ενδοϋαλοεδικά PD0325901 στη δόση των 0.1m ml ανά οφθαλμό ενώ η ομάδα ελέγχου έλαβε με τον ίδιο τρόπο BSS μόνο. Δώδεκα ημέρες αργότερα τα προτεινόμενα θεραπευτικά σχήματα χορηγήθηκαν στις ομάδες I-II ενώ οι ομάδες ΙΙΙ-IV έλαβαν BSS. Δύο εβδομάδες αργότερα έγινε ευθανασία των πειραματοζώων για να προσδιοριστεί η επίδραση όσων χορηγήθηκαν. Πριν την ευθανασία έγινε κλινική και οφθαλμολογική αξιολόγηση ενώ ακολούθησε ιστολογική ανάλυση μονιμοποιημένων τομών αμφιβληστροειδούς, ELISA για ποσοτικοποίηση εκκρινόμενων παραγόντων στο περιφερικό αίμα των ζώων και το υαλοειδές υγρό και Q-PCR για τη μέτρηση των επιπέδων έκφρασης σχετιζόμενων με την απόφραξη ή τη φλεγμονή γονιδίων. Μικρού μεγέθους παρόμοια των εμβρυϊκών βλαστοκύτταρων (VSELs) απομονώθηκαν από το περιφερικό αίμα των πειραματοζώων, ως σημάδι απόκρισης στη βλάβη 12 και 36 ημέρες μετά την επαγωγή ενώ χαρακτηρίστηκαν με χρώση αλκαλικής φωσφατάσης και Q-PCR για την έκφραση γονιδίων εμβρυϊκής φύσης.Τα νανοσωματίδια τροποποιημένης χιτοζάνης (nanoThioCHI) δεν παρουσίασαν κυτταροτοξική εικόνα στις κυτταροκαλλιέργειες ενώ η απελευθέρωση anti-VEGF εμφανίστηκε συνεχής για περίπου 8 ημέρες. Τα μη φυσιολογικά επαυξημένα επίπεδα EPCR που μετρήθηκαν στο in vitro μοντέλο προσομοίωσης RVO μειώθηκαν στατιστικά σημαντικά 24 και 48 ώρες μετά την έκθεση του πάσχοντος ενδοθηλίου στα nanoThioCHI-anti-VEGF και τα MSCs. Ωστόσο ο συνδυασμός τους φάνηκε να είναι περισσότερο αποδοτικός από την μεμονωμένη παρουσία του καθενός και μάλιστα σε χρονικό διάστημα 24 ωρών, συνοδευόμενος από παράλληλη μείωση των μεταγραφικών επιπέδων VEGF από τα κύτταρα. Περιορισμένο οίδημα, αιμορραγίες και αποκόλλησεις αμφιβληστροειδούς και βελτιωμένη κυτταρική οργάνωση παρατηρήθηκε στις ομάδες Ι και ΙΙ σε σύγκριση με τα παθολογικά συμπτώματα της ομάδας ΙΙΙ που παρουσίαζε εικόνα πλήρους ιστολογικής αποδιοργάνωσης συνδυασμένη με θετική χρώση ανοσοϊστοχημείας για δείκτες νεοαγγείωσης (FVIII) ή σχετιζόμενους με την απόφραξη. Σημαντική μείωση των υψηλών επιπέδων εκκρινόμενων φλεγμονωδών κυτοκινών μετρήθηκαν στο υαλοειδές υγρό των ομάδων Ι και ΙΙ, ενώ η έκφραση RVO-σχετιζόμενων γονιδίων και γονιδίων φλεγμονής μειώθηκε επίσης σημαντικά και ειδικότερα στην ομάδα ΙΙ. Θετικές χρώσεις ανοσοϊστοχημείας για δείκτες κυτταρικής αναγέννησης (ki-67, GFAP) παρατηρήθηκαν στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία. GFP+ ASCs, ικανά για διαφοροποίηση προς προγενήτορες νευρικών κυττάρων, ανιχνεύτηκαν στα κυτταρικά εναιωρήματα των ιστών της ομάδας ΙΙ, υποδεικνύοντας την πιθανή προσκόλλησή τους στην περιοχή που έχει υποστεί βλάβη. Η χρώση H&E στα κυτταρικά επιχρίσματα του περιφερικού αίματος αποκάλυψε την παρουσία κυττάρων πολύ μικρού μεγέθους με υψηλή αναλογία πυρήνα-κυτταροπλάσματος στην ομάδα RVO. Η θετική χρώση αλκαλικής φωσφατάσης σε συνδυασμό με την υπερέκφραση των γονιδίων Oct3/4, Nanog και Sox-2 επιβεβαίωσε την ύπαρξη αδιαφοροποίητων κυττάρων με εμβρυϊκά χαρακτηριστικά ως απόκριση στην επαγόμενη βλάβη. Συμπερασματικά η παρούσα διατριβή προτείνει μία θεραπεία βασισμένη στη χρήση βλαστοκυττάρων λιπώδους ιστού και συνοδευόμενη από τη διαρκή και χρονοελεγχόμενη απελευθέρωση anti-VEGF από βελτιωμένους νανοφορείς με στόχο το συνδυασμό της παρακρινούς δράσης των βλαστοκυττάρων με τον σταδιακό περιορισμό της παθολογικής νεοαγγείωσης για την αποτελεσματικότερη αντιμετώπιση της RVO.