Ανάπτυξη ενός κλινικά αξιοποιήσιμου πρωτοκόλλου διαφοροποίησης επαγόμενων πολυδύναμων βλαστοκυττάρων σε μεσεγχυματικά στελεχιαία κύτταρα

Abstract

Mesenchymal stem cells (MSCs) have gained much interest during the last years, due to their immunomodulatory and regenerative properties and they are being examined as a therapeutic tool for a wide variety of diseases. The most widely used MSC- source is the bone marrow, from which, though, only a limited amount of MSCs can be produced that is usually not sufficient for clinical use. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can represent an alternative source of MSCs that would overcome the limitations of the adult sources. Due to their property of pluripotency they can be used for large scale production of differentiated cells with potential to be used in regenerative medicine. In the current study, we aimed at developing a clinical scale protocol for the production of MSCs from iPSC lines that had been generated with integration-free method of reprogramming and at examining the properties of the produced MSCs. Two integration-free iPSC lines were expanded in in vitro cultures without feeder cells in order to derive sufficient numbers of cells. The lines were then cultured in low attachement plates, without FGF-2 for the formation of embryoid bodies and afterwards they were cultured on gelatin with appropriate MSC differentiation medium. The derived MSCs (iPSC-MSCs) were tested with flow cytometry for the expression of MSC markers. Their multilineage differentiation potential was examined under chondrogenic, osteogenic and adipogenic cultures. Their chondrogenic capacity was further examined in comparison with MSCs from bone marrow (BM-MSCs) histologically and immunohistochemically. Their proliferative capacity was examined in comparison with BM-MSCs under parallel cultures till senescence. They were also tested for in vivo tumor formation after administration in immunoincompetent mice and for downregulation of pluripotency markers Oct3/4 and Nanog. Their genomic stability was tested with array comparative genomic hybridization (aCGH).iPSCs were efficiently differentiated in MSCs, within a time interval of 3 weeks. iPSC-MSCs are similar to BM-MSCs and express the surface antigens CD105, CD73, CD44, CD90 whereas they are negative for CD34 and CD45. In vivo, they do not induce oncogenesis in immunoincompetent mice 10 weeks after administration. They have downregulated the expression of pluripotency markers. Differentiation did not induce chromosomal aberrations and iPSC-MSCs had similar chromosomal pattern as their parental iPSCs, including 2 deletions of 3Mb that had been generated during their expansion. The deletions were not related to aberrant proliferation of cells. The proliferative capacity of iPSC-MSCs was much higher than that of BM-MSCs with cumulative population doubling being 35.7 and 28.3 versus 16.9 and 17.8 in BM-MSCs. iPSC-MSCs had up to 5.88x1010 fold expansion, while the respective number in BM-MSCs was 2.3x105. iPSC-MSCs exhibited multilineage differention potential. However, the derived chondrogenic tissues did not have the typical hyaline cartilage morphology and proteoglycan composition and displayed poor expression of Sox9 and Collagen II, in contrast to BM-MSCs.For the first time in Greece, MSC lines are derived from integration-free iPSCs under safe and efficient protocols and their properties are examined in comparison with BM-MSCs. iPSCs can be a safe source of MSCs and can be stored in iPSC-bank allowing consecutive differentiation with potential to be used clinically in the future in cell therapy. iPSC-MSCs have great similarities with BM-MSCs, but their properties need to be further investigated in preclinical models of various diseases for the elucidation of their therapeutic effects.

Τα μεσεγχυματικά στελεχιαία κύτταρα (ΜΣΚ) έχουν κεντρίσει το ενδιαφέρον των ερευνητών αφού, λόγω των ανοσορυθμιστικών και αναγεννητικών τους ιδιοτήτων, εξετάζονται ως θεραπευτικό εργαλείο διαφόρων νοσημάτων. Η πιο συχνή πηγή παραγωγής ΜΣΚ είναι ο μυελός των οστών, από τον οποίο, όμως, μπορεί να παραχθεί ένας περιορισμένος αριθμός ΜΣΚ, που πολλές φορές δεν επαρκεί για κλινική χρήση. Μια εναλλακτική πηγή ΜΣΚ που παρακάμπτει τα προβλήματα χρήσης ΜΣΚ από ενήλικους ιστούς είναι τα επαγόμενα πολυδύναμα στελεχιαία κύτταρα (ΕΠΣΚ). Λόγω της πολυδυναμίας τους, τα ΕΠΣΚ μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την μεγάλης κλίμακας παραγωγή διαφοροποιημένων κυττάρων με σκοπό τη χρησιμοποίησή τους στην αναγεννητική ιατρική. Στην παρούσα μελέτη επιδιώξαμε να αναπτύξουμε κλινικής κλίμακας πρωτόκολλο παραγωγής ΜΣΚ από ΕΠΣΚ σειρές που δημιουργήθηκαν με ασφαλή μέθοδο επαναπρογραμματισμού χωρίς δεν ενσωμάτωση ξένου γενετικού υλικού και στη συνέχεια να διερευνήσουμε τα χαρακτηριστικά των παραχθέντων ΜΣΚ. Δύο σειρές ΕΠΣΚ που δε φέρουν ξένο DNA, πολλαπλασιάστηκαν χωρίς υποστηρικτικά κύτταρα σε κατάλληλες καλλιέργειες, ώστε να προκύψουν επαρκείς αριθμοί κυττάρων. Ακολούθως, οι σειρές ΕΠΣΚ καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία χαμηλής προσκόλλησης απουσία του παράγοντα FGF-2, προς σχηματισμό εμβρυικών σωματιδίων, τα οποία στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε ζελατίνη και υλικό διαφοροποίησης σε ΜΣΚ. Τα παραχθέντα ΜΣΚ (ΕΠΣΚ-ΜΣΚ) ελέγχθηκαν με κυτταρομετρία ροής για την έκφραση των τυπικών επιφανειακών αντιγόνων των ΜΣΚ. Κάτω από κατάλληλες συνθήκες καλλιέργειας ελέγχθηκε η διαφοροποίησή τους σε χονδροκύτταρα, οστεοκύτταρα και λιποκύτταρα. Επιπλέον, η ικανότητα χονδρογένεσής τους συγκρίθηκε με αυτήν των ΜΣΚ του μυελού των οστών (ΜΟ-ΜΣΚ) ιστολογικά και ανοσοϊστοχημικά. Το πολλαπλασιαστικό δυναμικό τους συγκρίθηκε με αυτό των ΜΟ-ΜΣΚ, μέσω παράλληλων, συνεχών ανακαλλιεργειών μέχρι να επέλθει το κυτταρικό γήρας. Η πιθανή in vivo ογκογενετική τους ικανότητα εξετάστηκε με υποδόρια χορήγησή τους σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια και ελέγχθηκε η έκφραση σε αυτά, των δεικτών πολυδυναμίας Nanog, Oct3/4. Η γενετική τους σταθερότητα ελέγχθηκε με μικροσυστοιχίες συκριτικού γονιδιωματικού υβριδισμού (aCGH). Τα ΕΠΣΚ διαφοροποιήθηκαν με μεγάλη αποδοτικότητα σε ΜΣΚ, μετά από καλλιέργεια 3 εβδομάδων. Τα ΕΠΣΚ-ΜΣΚ μοιάζουν με τα ΜΟ-ΜΣΚ και εκφράζουν τους επιφανειακούς δείκτες CD105, CD73, CD44, CD90 ενώ απουσιάζουν από αυτά οι δείκτες CD34, CD45. In vivo δε δημιουργούν όγκους σε ανοσοανεπαρκή ποντίκια έως και 10 εβδομάδες μετά την έγχυση, ενώ έχουν ελαττώσει την έκφραση των δεικτών πολυδυναμίας. Η διαφοροποίηση δεν προκάλεσε χρωμοσωμικές αλλαγές στα κύτταρα και αυτά διατηρούν το χρωμοσωμικό προφίλ των ΕΠΣΚ από όπου προήλθαν, συμπεριλαμβανομένων 2 ελλειμμάτων μεγέθους 3Mb, τα οποία προέκυψαν κατά τις συνεχείς ανακαλλιέργειες των ΕΠΣΚ, αλλά δε σχετίζονται με ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Παρουσιάζουν πολλαπλασιαστικό δυναμικό πολύ μεγαλύτερο από αυτό των MO-ΜΣΚ, με συνολικούς αριθμούς διπλασιασμών 35.7 και 28.3, έναντι 16.9 και 17.8 των ΜΟ-ΜΣΚ, ενώ μπορούν να αποδώσουν τον αρχικό αριθμό τους έως και 5.88x1010 φορές έναντι 2.3x105 στα ΜΟ-ΜΣΚ. Τα ΕΠΣΚ-ΜΣΚ in vitro διαφοροποιούνται σε χονδροκύτταρα, οστεοκύτταρα και λιποκύτταρα. Παρόλα αυτά, ο χόνδρος που σχηματίστηκε από τη διαφοροποίησή τους, ιστολογικά δεν είχε την τυπική οργάνωση και περιεκτικότητα σε πρωτεογλυκάνες του υαλώδους χόνδρου, ενώ παρουσίαζε ελάχιστη έκφραση των δεικτών Sox9, Collagen II, σε αντίθεση με τα ΜΟ-ΜΣΚ.Για πρώτη φορά στην Ελλάδα δημιουργούνται σειρές ΜΣΚ από ΕΠΣΚ που δε φέρουν διαγονίδια, κάτω από ασφαλή και αποδοτικά πρωτόκολλα και διερευνώνται οι ιδιότητές τους σε σχέση με τα ΜΟ-ΜΣΚ. Τα ΕΠΣΚ μπορούν να αποτελέσουν ασφαλή πηγή παραγωγής ΜΣΚ, με φύλαξη σε κυτταρική τράπεζα και συνεχή διαφοροποίηση, ενώ μελλοντικά μπορούν να αξιοποιηθούν σε πρωτόκολλα κυτταρικής θεραπείας. Τα ΕΠΣΚ-ΜΣΚ παρουσιάζουν μεγάλες ομοιότητες με τα ΜΟ-ΜΣΚ, αλλά χρήζουν περαιτέρω διερεύνησης, κυρίως σε προκλινικά μοντέλα ποικίλων ασθενειών, ώστε να αποσαφηνιστεί η θεραπευτική τους δράση.