Ο ρόλος των προδρόμων μεσεγχυματικών κυττάρων μυελού των οστών στην Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια

Abstract

Introduction Defective tissue repair and remodeling are main aspects of Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) pathophysiology. Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) have been implicated in this direction, as their functional impairment and recruitment could possibly contribute to disease development and progression. It is already known that chemokines, which are short positively charged peptides, are involved in BM-MSCs migration to areas of tissue injury. SDF-1a/CXCR4 axis is the most studied chemokine ligand and receptor and a crucial role in lung tropism has been recently suggested. Additionally, it has showed that accelerated ageing, a common COPD pathogenetic mechanism, affects migratory capacity of BM-MSCs.The present study characterizes for the first time the expression of migration related chemokine receptors and their ligands in BM-MSCs from COPD patients.MethodsStudy population consists of twelve COPD patients and seven healthy subjects that visited lung function department of our hospital from June 2009 to February 2013. Ethical approval has been granted by research committee of the hospital and informed written consent was obtained from each participant.All the study participants had lung function tests, peripheral blood sample and bone marrow aspiration collected. MSCs isolation and culture from bone marrow aspirate was conducted until cell passage 2. Subsequently, RNA extraction was performed and culture conditioned media was stored.CXCR4/SDF-1a and CCR7/CCL19-CCL21 mRNA levels were evaluated in BM-MSCs whereas SDF-1a protein levels in sera and BM-MSCs’ conditioned media were also evaluated.ResultsDemographic data showed no significant difference between COPD patients and healthy controls in view of age, gender, smoking history and body mass index. Lung Function Tests showed significant impairment in COPD group, as expected in comparison to control subjects. BM-MSCs were characterized based on their immunophenotypic propertied and their differentiation capacity, according to international minimal criteria for in vitro defining.CXCR4, SDF-1a, CCL19 and CCL21 mRNA levels were significantly reduced in COPD BM-MSCs while CCR7 levels were undetectable. Notably, SDF-1a protein levels were marginally elevated in both sera and ΒΜ-MSCs’ conditioned media while the increase in SDF-1a serum levels significantly correlated with disease severity in COPD.Conclusion Our findings show significant downregulation of SDF-1a and CXCR4 mRNA in BM-MSCs of COPD patients, indicating an involvement of the axis in the disease pathophysiology.

ΕισαγωγήΗ χρόνια τροποποιημένη φλεγμονή και η ελαττωματική ιστική επιδιόρθωση αποτελούν βασικούς παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς στη Χρόνια Αποφρακτική Πνευμονοπάθεια (ΧΑΠ), μια νόσο που αποτελεί την 3η κατά σειρά αιτία θανάτου παγκοσμίως με τεράστιο κοινωνικό και οικονομικό βάρος. Το κάπνισμα κυρίως αλλά και άλλοι βλαπτικοί παράγοντες είναι γνωστό ότι προκαλούν μια φυσιολογική φλεγμονώδη αντίδραση στο αναπνευστικό σύστημα, η οποία όμως σε μια συγκεκριμένη ομάδα ατόμων με προδιαθεσικούς παράγοντες μεταπίπτει σε χρόνια μη ρυθμισμένη φλεγμονή που συνεχίζει να υφίσταται και μετά την απομάκρυνση του εκλυτικού παράγοντα. Η χρόνια αυτή φλεγμονώδης διεργασία, στην οποία βασικό ρόλο παίζει το οξειδωτικό στρες και η ανισορροπία πρωτεασών/αντιπρωτεασών, έχει ως αποτέλεσμα την ίνωση του τοιχώματος των μικρών περιφερικών αεραγωγών, την καταστροφή του πνευμονικού παρεγχύματος και την αυξημένη παραγωγή βλέννης.Τα αρχέγονα μεσεγχυματικά κύτταρα που προέρχονται από το μυελό των οστών (BM-MSCs) άμεσα μετά την ανακάλυψη τους προσέλκυσαν το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας λόγω της ικανότητας τους για μετανάστευση στις περιοχές ιστικής βλάβης, για ιστική επιδιόρθωση και την ανοτροποποιητική τους δράση. Δεν είναι τυχαίο ότι μια πληθώρα μελετών σε μοντέλα ζώων με χρόνια εκφυλιστικά ή ανοσολογικά νοσήματα έχει ήδη πραγματοποιηθεί και παρέχει ισχυρά δεδομένα για την ασφάλεια των BM-MSCs αλλά και ενδείξεις για την αποτελεσματικότητα τους ως θεραπευτικοί παράγοντες. Στη ΧΑΠ υπάρχουν ήδη κλινικές μελέτες φάσης 1 που επιβεβαιώνουν την ασφάλεια της χορήγησης BM-MSCs σε ασθενείς, ενώ μεγαλύτερες μελέτες αποτελεσματικότητας απαιτούνται για να εκτιμηθεί η επίδραση της κυτταρικής αυτής θεραπείας.Τα BM-MSCs έχει αποδειχθεί ότι παρουσιάζουν τροπισμό σε περιοχές ιστικής βλάβης και η μετακίνηση τους ρυθμίζεται από μικρά θετικά φορτισμένα πεπτίδια, της χημειοκίνες. Ο Stromal-cell Derived Factor -1a (SDF-1a) μαζί με τον υποδοχέα του CXCR4 αποτελεί τον πλέον μελετημένο άξονα χημειοκινών και φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση των BM-MSCs στον πνεύμονα. Επιπλέον, η επιταχυνόμενη γήρανση, που τα τελευταία χρόνια έχουν υπάρξει ενδείξεις ότι συμμετέχει στην παθογένεση της ΧΑΠ, δύναται να επηρεάσει τη μεταναστευτική ικανότητα των BM-MSCs σε περιοχές βλάβης μέσω αλλαγής στην έκφραση των χημειοκινών και των υποδοχέων τους. Σκοπός της παρούσας μελέτης αποτελεί η εκτίμηση του άξονα SDF-1a/CXCR4 καθώς και του CCL19, CCL21/CCR7, που σχετίζονται με τη μετανάστευση των BM-MSCs σε ασθενείς με ΧΑΠ σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες.ΜέθοδοιΗ παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με την τροποποιημένη Διακήρυξη του Ελσίνκι και οι συμμετέχοντες συναίνεσαν με γραπτή συγκατάθεση να λάβουν μέρος σε αυτή. Ο πληθυσμός της μελέτης αποτελείται από δώδεκα ασθενείς με ΧΑΠ σύμφωνα με τα διεθνή κριτήρια διάγνωσης της νόσου που επισκέφθηκαν το σπιρομετρικό εργαστήριο του ΠΑΓΝΗ από τον Ιούνιο 2009 έως το Φεβρουάριο 2013. Η ομάδα ελέγχου αποτελείται από επτά ορθοπεδικούς ασθενείς με φυσιολογική σπιρομέτρηση οι οποίοι υποβλήθηκαν σε τακτική ορθοπεδική επέμβαση στα κάτω άκρα κατά το ίδιο χρονικό διάστημα.Όλοι οι συμμετέχοντες υποβλήθηκαν σε πλήρη λειτουργικό έλεγχο του αναπνευστικού συστήματος που περιλαμβάνει σπιρομέτρηση προ και μετά βρογχοδιαστολή, μέτρηση στατικών όγκων και διαχυτικής ικανότητας. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε λήψη δειγμάτων περιφερικού αίματος και κυττάρων μυελού των οστών. Από τα δείγματα μυελού των οστών πραγματοποιήθηκε απομόνωση και καλλιέργεια MSCs έως το κυτταρικό πέρασμα P2 και στη συνέχεια εξαγωγή RNA και αποθήκευση υπερκείμενου υγρού των κυτταροκαλλιεργειών. Στη συνέχεια έγινε ανασύνθεση cDNA και μετρήθηκε η mRNA έκφραση των SDF-1a, CXCR4, CCR7, CCL19 και CCL21. Ακόμη, υπολογίστηκαν μέσω ELISA τα επίπεδα της πρωτεΐνης SDF-1a τόσο στον ορό όσο και στο υπερκείμενο υγρό των κυτταροκαλλιεργειών. Τέλος, πραγματοποίηθηκε σύγκριση της mRNA έκφρασης των χημειοκινών και των υποδοχέων τους καθώς και των πρωτεϊνικών επιπέδων του SDF-1a ανάμεσα σε ασθενείς με ΧΑΠ και υγιείς μάρτυρες.ΑποτελέσματαΑπό τα δημογραφικά δεδομένα ασθενών και υγιών μαρτύρων δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην ηλικία, το φύλο, την καπνιστική συνήθεια και το δείκτη μάζας σώματος ανάμεσα στις δυο ομάδες. Όπως αναμενόταν σημαντικά μειωμένοι ήταν οι FEV1, FVC και ο λόγος FEV1/FVC στους ασθενείς με ΧΑΠ συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. Τα MSCs που απομονώθηκαν και καλλιεργήθηκαν από το μυελό των οστών ταυτοποιήθηκαν με βάση τα ανοσοφαινοτυπικά τους χαρακτηριστικά και την ικανότητα διαφοροποίησης τους σύμφωνα με τα διεθνή κριτήρια.Τα mRNA επίπεδα των CXCR4, SDF-1a, CCL19 και CCL21 μετρήθηκαν σημαντικά μειωμένα στα BM-MSCs ασθενών με ΧΑΠ, ενώ τα επίπεδα CCR7 δεν την ανιχνεύσιμα. Τα πρωτεϊνικά επίπεδα του SDF-1a ήταν οριακά αυξημένα τόσο στον ορό όσο και στο υπερκείμενο των BM-MSCs στην ομάδα της ΧΑΠ, ενώ η αύξηση των επιπέδων του SDF-1a στον ορό συσχετίστηκε σημαντικά με τη βαρύτητα της νόσουΣυμπέρασμαΗ παρούσα μελέτη παρέχει ενδείξεις πως η ρύθμιση της μεταναστευτικής ικανότητας των μεσεγχυματικών αρχέγονων κυττάρων μυελού των οστών μέσω της έκφρασης χημειοκινών δύναται να συμμετέχει στην παθογένεση της ΧΑΠ. Ο άξονας SDF-1a/CXCR4, που είναι γνωστό ότι παίζει σημαντικό ρόλο στις χημειοτακτικές ιδιότητες των BM-MSCs, παρουσιάζει μεταβολές στους ασθενείς με ΧΑΠ σε σχέση με υγιείς μάρτυρες, υποδηλώνοντας διαταραχή στη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων αυτών στις περιοχές ιστικής βλάβης. Μεγαλύτερης κλίμακας μελέτες απαιτούνται για να αποσαφηνιστεί πλήρως ο πιθανός αυτός παθογενετικός μηχανισμός σε ασθενείς με ΧΑΠ.