Η μεθυλίωση του DNA σε μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος (PBMCs) ασθενών με αυτοάνοση ηπατίτιδα (ΑΗ) και πρωτοπαθή χολική χολαγγειίτιδα (ΠΧΧ)

Abstract

Autoimmne hepatitis (AIH) and primary biliary cholangitis (PBC) are the two major autoimmune liver diseases, characterized by chronic inflammation of liver parenchyma that leads to end stage liver disease, if untreated. Their aetiopathognesis has not yet been completely elucidated. Since genetic factors are insufficient to explain the observed risk, the role of potential epigenetic modifications in diseases’ pathogenesis has to be clarified. The aim of the present study was to assess the contribution of epigenetic modifications in AIH and PBC pathogenesis. For this purpose, PBMCs from 10 AIH patients at diagnosis, 8 AIH patients at disease remission, 9 PBC patients and 10 healthy controls (HC) were used for further isolation of CD19(+) B and CD4(+) T lymphocytes with flow cytometry. Global DNA methylation (5mC)/hydroxymethylation (5hmC) was determined by ELISA, while the transcriptional levels of DNA methylation (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)/hydroxymethylation (TET1, TET2, TET3) enzymes were determined by quantitative PCR. Further analysis of the methylation level of specific CpG sites across the whole genome was performed by 850k array of Illumina. According to our findings, CD19(+) and CD4(+) lymphocytes from AIH patients at diagnosis are characterized by increased DNMT3A and reduced TET1 mRNA levels compared to PBC patients and HC respectively. DNMT3A mRNA levels are negatively associated with IgG serum levels, indicating a correlation between DNMT3A anddisease activity. Immunosuppression reduces DNMT3A levels in both CD19(+) and CD4(+) lymphocytes from AIH patients at disease remission. Interestingly, changes in DNMT3A and TET1 expression have no effect on global 5mC/5hmC levels in CD19(+) and CD4(+) cells from AIH patients, supporting the probable presence of differential methylation of isolated genes. This fact is futher supported by the methylation analysis across the whole genome, which revealed hypomethylation of several genes in AIH, in contrast to the hypermethylation of the majority of the differentially methylated genes in PBC. In addition, the hypomethylation of certain genes in AH patients at diagnosis is reversed after treatment administration. Some of the most differentially methylated genes were involved in pathways of innate immunity, development of cholestatis and of hepatocellular carcinoma. Last but not least, our study highlights the role of the X chromosome in PBC pathogenesis, a finding that is not verified in AIH. In conclusion, our study supports that AIH is characterized by altered expression of DNA methylation/hydroxymethylation enzymes, which is associated with disease activity, but also by hypomethylation of specific genes involved in immune pathways, which is reversed by immunosuppressive treatment. These findings open new insights in understanding disease’s pathogenesis and establishing novel, targeted therapeutic interventions.

Η αυτοάνοση ηπατίτιδα (ΑΗ) και η πρωτοπαθής χολική χολαγγειίτιδα (ΠΧΧ) είναι τα δύο κύρια αυτοάνοσα νοσήματα του ήπατος τα οποία χαρακτηρίζονται από χρόνια φλεγμονή, η οποία οδηγεί σε κίρρωση αν αφεθεί χωρίς θεραπεία. Καθώς οι γενετικοί παράγοντες, μόνοι τους, αδυνατούν να εξηγήσουν την αιτιοπαθογένειά των αυτοανόσων νόσων του ήπατος, η μελέτη των επιγενετικών παραγόντων θα μπορούσε να διαφωτίσει μέρος των μηχανισμών που σχετίζονται με την παθογένεση και την εξέλιξή τους. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η μελέτη της συμμετοχής των επιγενετικών μηχανισμών στην αιτιοπαθογένεια της ΑΗ και της ΠΧΧ με στόχο την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών στρατηγικών. Για το σκοπό αυτό περιφερικά μονοκύτταρα (PBMCs) 10 ασθενών με ΑΗ κατά τη διάγνωση (σε 8 από αυτούς έγινε μελέτη και κατά την επίτευξη πλήρους ανταπόκρισης μετά από χορήγηση ανοσοκαταστολης), 9 ασθενών με ΠΧΧ και 10 υγιών μαρτύρων (ΥΜ) χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση CD19(+) B και CD4(+) T λεμφοκυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Στη συνέχεια έγινε προσδιορισμός της ολικής μεθυλίωσης (5mC)/υδροξυμεθυλίωσης (5hmC) του DNA με τη χρήση ELISA, ενώ η έκφραση των ενζύμων μεθυλίωσης (DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)/υδρόξυμεθυλίωσης (ΤΕΤ1, ΤΕΤ2, ΤΕΤ3) σε μεταγραφικό επίπεδο, έγινε με τη χρήση ποσοτικής αντίδρασης πολυμεράσης (qPCR). Περαιτέρω ανάλυση της μεθυλίωσης των επιμέρους CpG αλληλουχιών κατά μήκος του γονιδιώματος έγινε με την αλληλουχία 850k της Illumina.Αυξημένη DNMT3A και χαμηλή ΤΕΤ1 χαρακτηρίζει τα CD19(+) και CD4(+) λεμφοκύτταρα των ασθενών με ΑΗ κατά τη διάγνωση συγκριτικά με τους ασθενείς με ΠΧΧ και τους ΥΜ αντίστοιχα. Τα επίπεδα mRNA της DNMT3A σχετιζόταν αρνητικά με την IgG ανοσοσφαιρίνη κατά τη διάγνωση της ΑΗ υποδηλώνοντας τη συσχέτισή της DNMT3A με τη δραστηριότητα της νόσου. Η χορήγηση ανοσοκατασταλτικής αγωγής βρέθηκε ότι μειώνει τα επίπεδα της DNMT3A στους ασθενείς με ΑΗ κατά την ύφεση της νόσου τόσο στα CD19(+) όσο και στα CD4(+) λεμφοκύτταρα. Οι αλλαγές στα επίπεδα των DNMT3A και ΤΕΤ1 δε συμβάδιζαν με σημαντικές διαφορές στο επίπεδο ολικής 5mC/5hmC, παραπέμποντας στην παρουσία εντοπισμένων επιγενετικών αλλαγών που επιδρούν στην έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων. Υπέρ του ευρήματος αυτού, συνηγορούν τα αποτελέσματα της ανάλυσης της μεθυλίωσης του συνόλου του γονιδιώματος των CD4(+) T λεμφοκυττάρων, που ανέδειξαν σημαντικές διαφορές στη μεθυλίωση μεμονωμένων γονιδίων μεταξύ ασθενών με ΑΗ έναντι των ΥΜ και των ασθενών με ΠΧΧ. Συγκεκριμένα, η πλειοψηφία των διαφορετικά μεθυλιωμένων γονιδίων στους ασθενείς με ΑΗ κατά τη διάγνωση βρέθηκαν υπομεθυλιωμένα, ενώ στους ασθενείς με ΠΧΧ παρατηρήθηκε υπερμεθυλίωση του πλείστου των διαφορετικά μεθυλιωμένων γονιδίων. Επιπλέον, η υπομεθυλίωση των γονιδίων στην ΑΗ επηρεαζόταν από την ανοσοκατασταλτική αγωγή. Μεταξύ των πλέον διαφορετικά μεθυλιωμένων γονιδίων αναδειχθηκαν γονίδια, που εμπλέκονται σε μονοπάτια φυσικής ανοσίας καθώς και γονίδια που συμμετέχουν σε μηχανισμούς ανάπτυξης χολόστασης και ηπατοκαρκινογένεσης. Επιπλέον, στην παρούσα μελέτη επιβεβαιώθηκε η σημασία του χρωμοσώματος Χ στην παθογένεια της ΠΧΧ, ενώ στην ΑΗ δεν υπήρχε αντίστοιχο εύρημα (τα περισσότερα διαφορετικά μεθυλιωμένα γονίδια εδράζονταν σε αυτοσωμικά χρωμοσώματα). Συμπερασματικά, η μελέτη μας δείχνει για πρώτη φορά, ότι η ΑΗ χαρακτηρίζεται από αλλαγές στην έκφραση των ενζύμων μεθυλίωσης/υδροξυμεθυλίωσης, που σχετίζονται με τη δραστηριότητα της νόσου, αλλά και από αλλαγές στη μεθυλίωση μεμονωμένων γονιδίων, που επηρεάζονται από τη χορήγηση ανοσοκαταστολτικής αγωγής. Αντίθετα, η ΠΧΧ χαρακτηρίζεται από υπερμεθυλίωση των περισσότερων διαφορετικά μεθυλιωμένων γονιδίων. Τα ευρήματα αυτά ανοίγουν νέους δρόμους για την κατανόηση της αιτιοπαθογένειας των αυτοανόσων νοσημάτων του ήπατος και την εύρεση νέων, στοχευμένων θεραπειών.