Ανάπτυξη καινοτόμου βιοδιυλιστηρίου για την παραγωγή βακτηριακής κυτταρίνης και προϊόντων διατροφής προστιθέμενης αξίας από υποπροϊόν τυποποίησης κορινθιακής σταφίδας

Abstract

Corinthian currants are produced by the natural drying of Vitis vinifera L. var. Apyrena grapes and is a historic Greek product, cultivated since antiquity. It does not undergo any heat treatments, addition of sweeteners or other additives, and can be consumed as such, added to bakery, confectionery and cooking products, or it can be processed for the production of syrups or concentrates for use as sweetener or as raw material for alcohol and beverage production. Today, Corinthian currants are still one of the main export commodities of the country, with Vostitsa currants being the top quality. However, the amount of currants produced is steadily declining, mainly due to the high production costs and the lack of governmental subsidies. A Corinthian currant processing company produces large quantities of finishing side-stream (FSS) (accounting for 5-6% of the processed raw material), which differs from the marketable product mainly in the size of the berries (<4 mm, >8 mm), and the presence of seeds. The analysis of chemical composition and aroma (volatile) profile of FSS have not been studied and is one of the objectives of the thesis. Also, FSS is currently used almost exclusively for the production of vinegar by submerged fermentation, as defined by Greek law until recently. However, FSS has a great potential for the biotechnological exploitation as a raw material rich in fermentable sugar (glucose, fructose, and sucrose, ~70%). Thus, it can be used for the production of value-added products, which today constitutes a real requisite for the currants processing companies, especially after the repeal of the corresponding restrictive legislation on the use of FSS.The aim of this thesis was therefore, to upgrade FSS, within the “Biorefinery” concept, for the production of various added-value food products (sweeteners, vinegar, wines, microbial food cultures), as well as biotechnological products (bacterial cellulose). The thesis also aimed at developing novel production methods that could lead to products with good organoleptic and nutritional quality, preservability, and low-production cost, which are key prerequisites for their industrial application. The biorefinery is also one of the key strategies for achieving a “Circular Economy”, through which the raw material “Loops” can be closed, through utilization of wastes and side-streams to produce useful products, leading to multiple socio-economic and environmental benefits.Another aim was the chemical analysis of FSS and its products, with emphasis on the phenolic content, antioxidant capacity and aromatic profile (of the thesis food products), and physicochemical texture characteristics (of bacterial cellulose, which finds applications in both the food and materials sectors). The First Part of the thesis provides a comprehensive overview of the literature on the current situation regarding the generation and utilization of food industry wastes in the context of achieving a circular economy. Data on Corinthian currants (production, composition, legislation, industrial side-streams, and current situation in the corresponding agro-industrial sector) are also reported. Then, reference is made on products that can be produced from raisins or grapes, and which are the objectives of the thesis (syrups, wines, vinegars, bacterial cellulose, microbial biomass). Information on the current economic situation of these product markets worldwide, on their production methods, their chemical composition and their nutritional value is also provided, as well as on the new trends at scientific and industrial level. The Second Part provides a detailed description of the experimental design of the thesis. The raw materials, microorganisms, chemical reagents, and laboratory equipment used are listed, and all the analytical and experimental techniques, applied or developed in the thesis, are described in detail. In the Third Part, the results and conclusions of the thesis are presented. Initially, an analysis of the FSS composition and aroma profile was carried out and compared with the marketable product from which the FSS was generated (Vostitsa currants). The main difference between the two materials is, as mentioned above, the size of the raisin berries and the presence of seeds and stems. These differences were also reflected on the chemical composition of FSS. In particular, the results showed that total sugar concentration (~ 71% w/w), protein (2.6% w/w), ash, pH, total acidity and organic acids were at similar levels in both FSS and the commercial product, while the moisture content, fat (0.66% w/w), volatile acidity (0.2% as acetic acid), phenolic content and antioxidant capacity were increased in the FSS. These differences, apart from the different nature of FSS, can also be attributed to the different treatment of FSS in relation to the marketable currant after their separation in the factory. In particular, the increased antioxidant capacity (av. 2.40 AAE/g) and phenolic content (av. 4.8 mg GAE/g) of FSS compared to the marketable raisins (av. 1,9 mg GAE/g and 2.40 AAE/g, respectively), can be attributed to the presence of seeds that are rich in antioxidant phenolics, and possibly to the chemical modification of the raisin phenolics during processing and storage of FSS.FSS also has a rich volatilome. In particular, 160 compounds were identified by SPME GC-MS, including (1) volatile compounds from the raw material (grapes or other parts of the vine plant), (2) sugar thermal breakdown products, such as Maillard and Strecker reaction products (e.g., diacetyl, furfural, phenylacetaldehyde, and Strecker aldehydes) formed during the dehydration of raisins, and (3) compounds of lipid metabolism (e.g., hexanal, heptanal, 2-heptenal, 2,4-decadienal, 2-nonanal), which probably derive from both from the metabolism of the vine and from the processing of the raisins (drying, storage, processing). The majority of these compounds were also identified in the products made from FSS. Finally, compounds not derived from grapes were also detected in both FSS and its products, but their presence can be attributed to impurities such as other parts of the vine plant (e.g., L-borneol from stems), or weeds (e.g., thujone). In addition to the above, the differences between FSS and the commercial product are also affected by soil and climatic conditions, the applied agricultural practices, the year of harvest, and the way the raisins are dried.However, the levels of acidity and the presence of specific volatile compounds (such as acetate esters, higher alcohols, aliphatic hydrocarbons, etc.) in FSS, are indicative of microbial spoilage. For this reason, it is suggested that attention should be given on the handling of FSS in the factory, after its separation from the marketable product, to reduce its microbial load and spoilage, especially when it is destined for the production of food products. The presence of mycotoxins in the FSS should also be investigated. As regards to the solid FSS residues (FSSR) left after the aqueous extraction of FSS for the production of the various products of the thesis, it was found to contain lower amounts of total nitrogen (protein) (av. 2.4%), while ash, fat, total and volatile acidity as well as pH were higher than those of FSS. On the contrary, the phenolic content (30.3±3.0 mg GAE/g) and antioxidant capacity (21.9±5.2 mg AAE/g) were higher, indicating its potential use as an additive in foods or beverages with high antioxidant activity, while it is also a good substrate for microbial processing to produce bio-enriched foods or animal feeds (e.g., "synbiotic" foods). From the FSS, 4 types of syrups were initially prepared (density 38-40oBe), two "brown" and two "blonde" syrups, with/without partial removal of tartrate. All syrups had similar glucose content (31.3-35.4%w/w), fructose (30.5-34.5%) and total sugars (65.1-68.8%), and in addition all contained traces of sucrose. The total acidity of the syrups was similar. They also had similar contents of total nitrogen, except for the blonde syrups that had lower content due to their production method (clarification and discoloration). The volatile acidity of all syrups was at low levels (0.08-0.27%), indicating that they did not suffer significant microbial alterations during their preparation. The blonde syrups had a higher pH value (~5.5-6.0) due to the partial precipitation of tartrate. The phenolic content of the brown syrups was higher (185-213 mg GAE/100 g), since in the blonde ones (134-143 mg GAE/100 g) part of the phenolic compounds and pigments were removed by activated carbon. The brown syrups, as expected, had greater antioxidant capacity (0.90-1.0 mg AAE/g) than the blonde ones (0.29-0.58 mg AAE/g). Regarding the SO2 addition process of the FSS extracts for the production of syrups, it was concluded that laboratory tests should be carried out in order to regulate the residual amount of SO2 in the final products to the desirable levels, since the stoichiometric calculation of the oxidant (e.g., H2O2) required to oxidize SO2 does not properly function due to the presence of other antioxidant compounds in the FSS. Improvements in this regard may also concern application of FSS sterilization techniques prior to the extraction and condensation in order to completely avoid SO2 addition in syrups production. In total, 144 volatile compounds were detected in the syrups by SPME GC-MS. From these compounds, carbonyls were found at higher levels in syrups compared to FSS, the major being 2- and 3-methylbutanal, acetone, furfural, 5-methyl-2-furfural and 1-ethyl-2-formylpyrrolle. In general, most of the identified compounds were either produced during the dehydration of raisins as lipid oxidation products or as products of the Maillard reaction (carbonyl compounds, furans, furfuryl compounds). On the other hand, hydroxy-methylfurfural (HMF) or acrylamide were not detected in any of the syrups, since their production involved concentration under vacuum at low temperature (45οC). From the sensory evaluations, microbiological analyses, and volatile acidity levels, it was shown that the FSS syrups (with the proposed production methods) were good quality and easy to preserve products, while during their production and storage they did not develop microbial alterations. They were generally described as products with a strong aftertaste, good but not strong odor, good sweet/sour taste or similar to honey, and without a metallic feel. Their color was similar to that of honey for the brown syrups and golden-yellow for the blonde syrups. Finally, the FSS syrups can be considered products with a high nutritional value and suitable (in moderate amounts) for diabetics as they contain a high fructose content and no sucrose. Following, FSS jams were prepared with/without the addition of pectin and with/without preservatives. The jams generally had similar characteristics to the commercial grape jam used for comparisons. Some differences among them may be attributed to the different raw material and the different way of production. All jams had a similar phenolic content (2.2-3.2 mg GAE/g), while their antioxidant capacity was 1.16-0.96 mg AAE/g.From the microbiological analyses and volatile acidity levels (0.044-0.066%) it appeared that the products were easy to preserve. The phenolic content of the jams was at similar levels as that reported in the literature, and they did not contain HMF, although they were prepared by a more intense heat treatment than the syrups. Also, a total of 144 volatile compounds were identified by SPME GC-MS. Of these, certain groups such as alcohols, organic acids, lactones, and hydrocarbons, were greatly reduced in the jams compared to the raw material (due to dilution and loss due to evaporation during boiling). As in syrups, the percentages of carbonyl compounds (almost doubled) and terpenes (possible hydrolysis of their bound forms) increased in the jams. Of the Maillard reaction compounds (except carbonyl compounds), 2-acetylfuran appeared at particularly high levels in the jams. Also, very high was the level of 2-octenal, a substance found in grapes and raisins as a product of the oxidation of unsaturated fatty acids by grape lipoxygenase, and as a product of the Maillard reaction. Therefore, its increased concentration in the jams is justified. The differences in the volatile profile between jams and syrups obviously depend on the different temperature and time of their processing. Regarding taste and appearance, the jams were characterized as pleasant and were well accepted by the testers. Also, it was shown that the addition of preservatives or pectin was not necessary, as the jam made without additives had similar texture and shelf-life with the jams that contained additives. Finally, they can be considered products with a high nutritional value and suitable for diabetics (in moderate amounts) as they do not contain added sugar and their sweetness is by half attributed to fructose. The production of dry wine from FSS extracts at various temperatures (4, 10, 15, 22oC) was then studied, using free and immobilized cells of the cryotolerant and alcohol-resistant strain Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1 which has been previously studied extensively in food and biofuel applications. The use of cell immobilization techniques can offer advantages over free cell systems, such as increased productivity, increased cell viability, operational stability, low fermentation capacity, and improved product quality. Especially, the combination of cell immobilization and fermentation at extremely low temperatures has been previously shown to lead to improved quality of both alcoholic and acetous fermentation products. The temperature significantly affected the wine fermentation times, while it did not significantly affect the levels of fermented sugar, ethanol, total and volatile acidity. The immobilized biocatalyst maintained its operational stability for more than 6 weeks, even at 4oC. The wines had better clarity than those made with free cells, they contained traces of sugar and the ethanol content was ~11.2%. Methanol was also not detected, which means that the grape pectin methylesterase was deactivated during the dehydration of the raisins. The low or no methanol content makes dry wines ideal raw materials for the production of distilled spirits, which can bring even higher added value to the FSS. Therefore, a future study for the production of spirits from FSS (“raisin brandy”) is strongly recommended. The pH of dry wines produced with immobilized cells was slightly lower, although total and volatile acidity were slightly higher in wines made with free cells. However, the observed changes were statistically insignificant. The same was observed for individual organic acids, except succinic, which was more abundant in wines produced by immobilized cells. The phenolic content was slightly lower than most white wines. Therefore, it is proposed to optimize the extraction of FSS in order to recover more phenolic components in the extracts. The phenolic content was also reduced at lower fermentation temperatures using immobilized cells. This can be a disadvantage in terms of the nutritional value of the wines, but not necessarily a technological disadvantage, since the phenolic components affect the taste, aroma and clarity of the wines, and the final product quality will depend on the winemaking practices that will be applied (fermentation temperature, use or not of immobilized cells, clarification, and other post-fermentation treatments). The individual phenolic components in the wines made using immobilized cells, as determined by RP-HPLC, were gallic, vanillic, p-coumaric and caffeic acids. A similar reduction at the lower fermentation temperatures was observed for these compounds. Vanillic acid was the major phenolic acid found in wines made at 22oC. A total of 160 volatile compounds were identified in the dry wines. In particular, the wines contained higher levels of terpenes than FSS (indicating hydrolysis of their bound forms in the wines), and a large number of volatile compounds (mainly esters) derived from fermentation. The effect of yeast immobilization on the wine volatile profile was as described in previous studies (higher ester levels by immobilized cells and at lower fermentation temperature). The wine prepared by immobilized cells had better clarity, without any sediments. Also, the intensity of the color was characterized as pale to moderate, and the shade was described as light, amber-like. As far as the aroma is concerned, a moderate aroma intensity was observed in both types of wines. They were generally characterized as dry, low-tannin, light-body and moderate intensity of flavor, acidity, and aftertaste. The alcohol sensation was medium for both wines tested.Subsequently, three types of sweet wines from FSS with alcohol content ~15.5% were prepared. One wine was made by addition of alcohol to stop the alcoholic fermentation. The other two wines were prepared by complete fermentation and then addition of FSS or brown syrup to achieve the desired sweetness. Most of their characteristics were similar to those of commercial sweet table wines. Total acidity ranged from ~7 g tartaric acid/l with higher acidity observed in the wines made by addition of FSS or syrup. The volatile acidity and pH of all wines were low. The main organic acids of the wines were tartaric and malic acid, while they contained much lower concentrations of citric, acetic, and succinic acids. All wines had similar phenolic content (244-325 mg GAE/l) and antioxidant capacity. In the sweet wines, 160 volatile compounds were identified, the same as those found in the dry wines. Regarding their appearance, a high clarity was observed for all three wines, without any sediments. The intensity of the color was characterized as intense with shades of light brown-orange to dark-amber. They were described as wines of high sweetness, moderate acidity, with a strong raisin taste and moderate aftertaste. The alcohol sensation was moderate to high for all three wines tested. In conclusion, the sweet wines prepared by the proposed methods are similar to sweet table wines with the main difference being the lower levels of phenolic content and antioxidant capacity (according to the literature, since no analysis of commercial wines was performed with the analytical methods applied in this thesis). To conclude, the proposed methods, led to wines of very good organoleptic quality, which could all be commercialized as raisin liquors, and of significantly reduced production cost since no ethanol addition is required. The production of vinegar from sweet FSS wine by immobilized and free cells of a wild vinegar culture, as well as a mixed culture of selected acetic acid bacteria, was then studied. Specifically, a fast fermenting species (Acetobacter aceti DSM 3508) and a species with high tolerance to acetic acid (Komagateibacter europaeus DSM 6160) were used. Also, the acetification capacity of the cultures after storage at low temperature for 2 months was studied. The results showed that in all cases the acetification time was slightly reduced from batch to batch (cell adaptation and operational stability of the system), and significantly reduced by the use of immobilized cells (increased productivity-reduced process cost). These results agree with previous studies on the increase of productivity by cell immobilization in other fermentation processes, such as alcoholic and lactic acid fermentation. Moreover, the storage of the cultures at low temperature in the refrigerator did not inactivate them but increased the time of the subsequent acetification batch. The use of the mixed culture of selected bacteria also resulted in a reduction of the acetification time, compared to the wild culture, thus ensuring better yields and evolution of the fermentation process. The phenolic content and antioxidant capacity were higher in the case of vinegars made by free cells (due to adsorption of phenolic compounds on the immobilization carrier), however it was at similar levels of common white wine vinegars. Comparing the different vinegar products regarding their volatile profiles, it can be observed that higher percentages of esters were contained in the products made by immobilized cells. Also, the esters in the products were increased by 8-fold compared to FSS. Larger percentages of alcohols were also contained in the vinegars made by the wild culture using free cells. The percentages of organic acids were similar in most samples, except for the vinegar made with free cells of the selected bacteria. Also, the products showed reduced percentages of terpenes, lactones and carbonyl compounds in relation to FSS. The results are encouraging for the production of vinegar from FSS using immobilized cells of selected acetic acid bacteria, provided that the application in the industry will involve specialized personnel, as well as the appropriate post-fermentation treatments. The thesis also proposes the use of FSS as raw material for the production of bacterial cellulose (BC), which, although is approached as a material with a variety of applications (hence its physicochemical properties were analyzed), it can also be used as food of high nutritional value (high in dietary fiber/prebiotic food). The results of the BC production optimization study with the microorganism Komagataeibacter sucrofermentans DSM 15973 in FSS extracts (FSSE) (using the Response Surface Methodology based on the Central Composite Design) show that the addition of N-sources to FSSE is necessary for optimal BC yield. The pH and incubation temperature also played an important role. Specifically, the ideal combination for optimal BC performance in FSSE was 28.07oC, pH 6.42, sugar concentration of 46.24 g/l and the addition of 2 N-sources, yielding 18.4-0.06 g/l BC. Using FSSE/whey mixture as a substrate, the ideal combination for optimal BC performance was pH 6.36 and addition of 1.7% yeast extract, leading to a production of 18.9±0.7 g/l BC. Therefore, whey can be used by K. sucrofermentans as a cheap N-source and source of other micronutrients required for the production of BC.Also, the method of BC drying after its production (thermal, freeze-drying) leads to various shapes and textures of the product (clear film with polymeric appearance and texture, with high permeability and ductility, or a texture similar to paper or cotton). The physicochemical texture analysis (porosimetry, SEM, FT-IR, XRD, TGA/TDA) showed that BC consists of cross-linked, but relatively highly oriented fibers (with nanoscale widths), which create a dense three-dimensional network structure, while the volume of its pores is similar to or greater than other types of plant delignified celluloses. Finally, the FSSEs of lower density remaining from the production of the above products, were used for the production of microbial biomass. Specifically, the production of baker’s or winemaking yeast (S. cerevisiae) was studied. The results showed that intensive air supply and the addition of N-source is necessary to increase the production efficiency of biomass in the FSSEs. The addition of N, P, S and Mg nutrients (in the form of inorganic salts) further increases the yields. The maximum cell mass yield achieved was 45.0±1.3 g /l and 40.9±2.5 g /l FSSE, for baker’s yeast and S. cerevisiae AXAZ-1, respectively. The viability of the baker’s yeast produced was examined over a period of 3 months and was found to be satisfactory, while its composition was similar to that of the commercial baker’s yeast used as inoculum. The technoeconomic analysis for a complete industrial wine production process (using immobilized cells) (780 m3 /year) and baker’s yeast (24.6 tn/year) with FSS as the raw material (7.5 m3/day, for 120 days/year) showed that the investment is realistic and worthwhile. For a Zero Net Present Value (NPV), the Minimum Sale Price (MSP) is estimated at $7.75/tn cumulatively for dry wine and baker’s yeast, or $0.08/kg of product.At the end of the thesis, the conclusions on the results are presented, which show that FSS is a raw material with high nutritional value, suitable for use as raw material for a variety of products such as wines, syrups, jams, vinegar, microbial metabolites and microbial biomass. The cell immobilization technique in all cases improved both the quality of the final products and in the efficiency of the processes. The novel methods used to produce sweet wines and sweeteners were suitable for the production of good quality products with low production costs. Finally, future actions are proposed in order to improve the quality of the proposed products and their manufacturing methods, the production of additional products from FSS, and the evaluation of their possible industrial application, in order to utilize the entire amount of FSS and create added value, within the biorefinery concept.

Η Κορινθιακή σταφίδα προέρχεται από τη φυσική αποξήρανση των σταφυλιών της ποικιλίας σταφυλιού Vitis vinifera L. var. Apyrena και αποτελεί αρχαίο εθνικό προϊόν. Δεν υφίσταται θερμική επεξεργασία, προσθήκη γλυκαντικών μέσων ή άλλων προσθέτων, και μπορεί να καταναλωθεί αυτούσια ή να προστεθεί σε προϊόντα αρτοποιίας, ζαχαροπλαστικής και μαγειρικής, ενώ με κατάλληλη κατεργασία μπορεί να μετατραπεί σε σιρόπι ή συμπυκνωμένο γλεύκος και να χρησιμοποιηθεί ως γλυκαντική ύλη (σταφιδίνη) ή ως πρώτη ύλη για την παραγωγή οινοπνεύματος και ποτών. Σήμερα, η Κορινθιακή σταφίδα εξακολουθεί να αποτελεί ένα από τα βασικότερα εξαγωγικά προϊόντα της Ελλάδας, με την Κορινθιακή σταφίδα Βοστίτσα να είναι η ανώτερη ποιοτικά. Ωστόσο, οι παραγόμενες ποσότητες ξηρής σταφίδας είναι δυστυχώς σταθερά φθίνουσες κυρίως λόγω του μεγάλου κόστους παραγωγής, και της έλλειψης κυβερνητικών επιδοτήσεων. Μια εταιρεία τυποποίησης Κορινθιακής σταφίδας παράγει μεγάλες ποσότητες υποπροϊόντος τυποποίησης (ΥΤΚ) ή «βιομηχανικού παρακρατήματος» (5-6% της πρώτης ύλης), το οποίο διαφέρει από το εμπορεύσιμο προϊόν κυρίως στο μέγεθος των καρπών (<4 mm, >8 mm), και την παρουσία γιγάρτων. Η χημική σύσταση και το αρωματικό προφίλ (πτητικές ενώσεις) του ΥΤΚ δεν έχουν μελετηθεί, και αποτελούν έναν από τους στόχους της διατριβής. Επίσης, το ΥΤΚ χρησιμοποιείται σήμερα σχεδόν αποκλειστικά για την παραγωγή ξυδιού με ζύμωση βυθού, όπως μέχρι πρόσφατα όριζε η Ελληνική νομοθεσία. Ωστόσο, το ΥΤΚ παρουσιάζει μεγάλες δυνατότητες βιοτεχνολογικής εκμετάλλευσης ως πρώτη ύλη πλούσια σε ζυμώσιμα σάκχαρα (γλυκόζη, φρουκτόζη και σακχαρόζη, ~70%). Έτσι μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή προϊόντων προστιθέμενης αξίας, που αποτελεί σήμερα πραγματικό ζητούμενο για τις εταιρείες τυποποίησης σταφίδας, ειδικά μετά την άρση της αντίστοιχης περιοριστικής νομοθεσίας για την χρήση του ΥΤΚ. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η αναβάθμιση του ΥΤΚ, υπό την ιδέα του «Βιοδιυλιστηρίου», μέσω αξιοποίησής του για την παραγωγή διάφορων προϊόντων διατροφής, προστιθέμενης αξίας (γλυκαντικές ύλες, ξύδι, οίνοι, μικροβιακές καλλιέργειες για τρόφιμα), αλλά και προϊόντων βιοτεχνολογικού ενδιαφέροντος (βακτηριακή κυτταρίνη). Επίσης, στόχος είναι η ανάπτυξη νέων μεθόδων παραγωγής των παραπάνω, οδηγώντας σε προϊόντα με καλή οργανοληπτική και διατροφική ποιότητα και διατηρησιμότητα, καθώς και με χαμηλό κόστος παραγωγής, που αποτελούν βασικές προϋποθέσεις για την βιομηχανική εφαρμογή τους. Το δε «βιοδιυλιστήριο», είναι μια από τις βασικές στρατηγικές για την επίτευξη «Κυκλικής Οικονομίας», μέσω του οποίου μπορεί να κλείσουν οι «Βρόγχοι» των πρώτων υλών, μετατρέποντας υπολείμματα διεργασιών σε χρήσιμα προϊόντα, με πολλαπλά κοινωνικά, οικονομικά και περιβαλλοντικά οφέλη. Στόχος της διατριβής ήταν επίσης η χημική ανάλυση του ΥΤΚ και των προϊόντων από ΥΤΚ, με έμφαση στο φαινολικό περιεχόμενο, την αντιοξειδωτική ικανότητα και το αρωματικό προφίλ, όσον αφορά τα προϊόντα διατροφής, και τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά υφής όσον αφορά τη βακτηριακή κυτταρίνη (που βρίσκει εφαρμογές τόσο στην παραγωγή τροφίμων όσο και υλικών). Στο Πρώτο Μέρος της διατριβής γίνεται μια διεξοδική επισκόπηση της βιβλιογραφίας όσον αφορά την υφιστάμενη κατάσταση σχετικά με την αξιοποίηση αποβλήτων και υποπροϊόντων της βιομηχανίας τροφίμων, στο πλαίσιο επίτευξης κυκλικής οικονομίας. Επίσης, αναφέρονται στοιχεία για την Κορινθιακή σταφίδα (παραγωγή, σύσταση, νομοθεσία, βιομηχανικό παρακράτημα, και υφιστάμενη κατάσταση στον αγροτοβιομηχανικό κλάδο παραγωγής και επεξεργασίας της). Στη συνέχεια, γίνεται αναφορά στα προϊόντα που μπορούν να προκύψουν από σταφίδα ή σταφύλι, και που αποτελούν στόχους της διατριβής (σταφιδίνη, σταφιδίτης οίνος, ξύδι, βακτηριακή κυτταρίνη, μικροβιακές καλλιέργειες για τρόφιμα). Αναφέρονται επίσης στοιχεία για την υφιστάμενη οικονομική κατάσταση αυτών των κλάδων σε παγκόσμιο επίπεδο, για τις μεθόδους παραγωγής των προϊόντων, τη χημική σύσταση και διατροφική τους αξία, καθώς και τις νέες τάσεις στην παραγωγή τους σε επιστημονικό και βιομηχανικό επίπεδο. Στο Δεύτερο Μέρος της διατριβής περιγράφεται αναλυτικά ο πειραματικός σχεδιασμός της διατριβής. Αναφέρονται οι πρώτες ύλες, οι μικροοργανισμοί, τα χημικά αντιδραστήρια, και ο εργαστηριακός εξοπλισμός που χρησιμοποιήθηκε, και περιγράφονται λεπτομερώς όλες οι αναλυτικές τεχνικές και οι πειραματικές πορείες που εφαρμόστηκαν ή αναπτύχθηκαν στη διατριβή. Στο Τρίτο Μέρος παρουσιάζονται τα αποτελέσματα και συμπεράσματα της διατριβής. Αρχικά πραγματοποιήθηκε ανάλυση της σύστασης και του αρωματικού προφίλ του ΥΤΚ και έγινε σύγκρισή του με το εμπορεύσιμο προϊόν από το οποίο προήλθε το ΥΤΚ (Κορινθιακή σταφίδα Βοστίτσα). Η κύρια διαφορά μεταξύ των δύο, όπως προαναφέρθηκε, είναι το μέγεθος των καρπών, η ποσότητα των φλοιών που περιέχουν και η παρουσία γιγάρτων και μίσχων. Οι διαφορές αυτές βρέθηκε ότι αντανακλούν και στη χημική σύσταση του ΥΤΚ. Συγκεκριμένα, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ολική συγκέντρωση σακχάρου (~71% w/w), η πρωτεΐνη (2,6% w/w), η τέφρα, το pH, η ολική οξύτητα και τα οργανικά οξέα ήταν σε παρόμοια επίπεδα στο ΥΤΚ και στο εμπορικό προϊόν, ενώ η περιεχόμενη υγρασία, το λίπος (0,66% w/w), η πτητική οξύτητα (0,2% ως οξικό οξύ), το φαινολικό περιεχόμενο και η αντιοξειδωτική ικανότητα ήταν αυξημένα στο ΥΤΚ. Ο διαφορές αυτές, εκτός από τη διαφορετική φύση του ΥΤΚ, μπορεί να αποδοθούν και στην διαφορετική μεταχείριση του ΥΤΚ στο εργοστάσιο σε σχέση με την εμπορεύσιμη σταφίδα μετά το διαχωρισμό τους. Ειδικότερα, η αυξημένη αντιοξειδωτική ικανότητα (μ.ο. 2,40 AAE/g) και το φαινολικό περιεχόμενο (μ.ο. 4,8 mg GAE/g) του ΥΤΚ σε σύγκριση με την εμπορεύσιμη σταφίδα (μ.ο. 1,9 mg GAE/g και 2,40 AAE/g, αντίστοιχα), οφείλεται στην παρουσία γιγάρτων που είναι πλούσια σε αντιοξειδωτικές φαινόλες, και πιθανώς στην χημική τροποποίηση των φαινολών της σταφίδας κατά την επεξεργασία και διαλογή. Το ΥΤΚ παρουσιάζει επίσης πλούσιο προφίλ πτητικών ενώσεων που επηρεάζουν το άρωμα. Συγκεκριμένα, ταυτοποιήθηκαν με SPME GC-MS 160 ενώσεις, συμπεριλαμβανομένων (1) πτητικών ενώσεων από την πρώτη ύλη (σταφύλι και μέρη του φυτού της αμπέλου), (2) προϊόντων θερμικής διάσπασης των σακχάρων, που προκύπτουν κατά την αφυδάτωση των σταφίδων, όπως ενώσεις των αντιδράσεων Maillard και Strecker (π.χ., διακετύλιο, φουρφουράλη, φαινυλακεταλδεΰδη, Strecker αλδεΰδες), και (3) ενώσεων του μεταβολισμού των λιπιδίων (π.χ., εξανάλη, επτανάλη, 2-επτενάλη, 2,4-δεκαδιενάλη, 2-εννεανάλη), που πιθανώς προέκυψαν τόσο από το μεταβολισμό της αμπέλου όσο και κατά την επεξεργασία της σταφίδας (ξήρανση, αποθήκευση, τυποποίηση). Η πλειοψηφία των ενώσεων αυτών ταυτοποιήθηκαν και στα προϊόντα από ΥΤΚ. Τέλος, ανιχνεύθηκαν, τόσο στο ΥΤΚ όσο και στα προϊόντα του, ενώσεις που δεν προέρχονται από το σταφύλι, αλλά η παρουσία τους μπορεί να αποδοθεί σε προσμίξεις, όπως από άλλα μέρη του φυτού της αμπέλου (π.χ., L-βορνεόλη από τους βοστρύχους), και από ζιζάνια της αμπέλου (π.χ., θουγιόνη). Εκτός φυσικά των παραπάνω, οι διαφορές μεταξύ του ΥΤΚ και του εμπορικού προϊόντος επηρεάζονται επίσης από τις εδαφοκλιματικές συνθήκες, τις εφαρμοζόμενες αγροτικές πρακτικές, το έτος συγκομιδής, αλλά και τον τρόπος ξήρανσης της σταφίδας. Τα επίπεδα οξύτητας και η παρουσία συγκεκριμένων πτητικών ενώσεων (όπως οξικοί εστέρες, ανώτερες αλκοόλες, αλειφατικοί υδρογονάνθρακες, κ.α.) στο ΥΤΚ, αποτελούν ένδειξη μικροβιακής αλλοίωσης. Για το λόγο αυτό προτείνεται να τροποποιηθεί η διαχείριση του ΥΤΚ στο εργοστάσιο, μετά από το διαχωρισμό του από το εμπορεύσιμο προϊόν, ώστε να μειωθεί το μικροβιακό του φορτίο και να περιοριστούν οι αλλοιώσεις, ειδικά όταν πρόκειται να αξιοποιηθεί για την παραγωγή προϊόντων διατροφής. Η παρουσία μυκοτοξινών στο ΥΤΚ θα πρέπει επίσης να διερευνηθεί. Όσον αφορά το στερεό υπόλειμμα (ΣΥΤΚ) που απομένει μετά την υδατική εκχύλιση του ΥΤΚ για την παραγωγή των διάφορων προϊόντων της διατριβής, αυτό βρέθηκε ότι περιέχει μικρότερο ποσοστό ολικού αζώτου (πρωτεΐνη) (μ.ο. 2,4%), ενώ η τέφρα, το λίπος, η ολική και η πτητική οξύτητα καθώς και το pH ήταν μεγαλύτερα σε σχέση με το ΥΤΚ. Αντίθετα, το φαινολικό περιεχόμενο (30,3±3,0 mg GAE/g) και η αντιοξειδωτική ικανότητα (21,9±5,2 mg AAE/g) ήταν υψηλότερα, υποδεικνύοντας δυνατότητα χρησιμοποίησής του ως πρόσθετο σε τρόφιμα ή αφεψήματα με υψηλή αντιοξειδωτική δράση, ενώ αποτελεί καλό υπόστρωμα για μικροβιακή κατεργασία με στόχο την παραγωγή βιο-εμπλουτισμένων τροφίμων ή ζωοτροφών (π.χ., «συνβιοτικά» τρόφιμα). Από το ΥΤΚ παρασκευάστηκαν αρχικά 4 τύποι σιροπιών (πυκνότητας 38-40oBe), δύο «καστανά» και δύο «ξανθά», με τρυγία και με μερική απομάκρυνσή της. Όλα τα σιρόπια που παρασκευάσθηκαν είχαν παρόμοιο περιεχόμενο (% w/w) γλυκόζης (31,3-35,4%), φρουκτόζης (30,5-34,5%) και συνολικών σακχάρων (65,1-68,8%), και επιπλέον όλα περιείχαν ίχνη σακχαρόζης. Η ολική οξύτητα των σιροπιών ήταν παρόμοια. Επίσης, είχαν παραπλήσιες τιμές ολικού αζώτου, εκτός των ξανθών που είχαν μικρότερη περιεκτικότητα λόγω του τρόπου παραγωγής τους (διαύγαση και αποχρωματισμός). Η πτητική οξύτητα κυμάνθηκε σε χαμηλά επίπεδα (0,08-0,27% w/w), που αποτελεί ένδειξη ότι δεν υπέστησαν σημαντικές μικροβιακές αλλοιώσεις κατά την παρασκευή τους. Τα ξανθά σιρόπια είχαν υψηλότερη τιμή pH (~5,5-6,0) λόγω της μερικής καταβύθισης της τρυγίας. Το φαινολικό περιεχόμενο ήταν υψηλότερο στα καστανά σιρόπια (185-213 mg GAE/100 g), αφού στα ξανθά (134-143 mg GAE/100 g) απομακρύνθηκε ένα μέρος των φαινολικών ενώσεων και χρωστικών με ενεργό άνθρακα. Τα καστανά σιρόπια, όπως ήταν αναμενόμενο, εμφάνισαν μεγαλύτερη αντιοξειδωτική ικανότητα (0,90-1,0 mg ΑΑΕ/g) σε σχέση με τα ξανθά (0,29-0,58 mg ΑΑΕ/g). Όσον αφορά την διεργασία θείωσης των γλευκών για την παραγωγή των σιροπιών, προκύπτει πως πρέπει να προηγούνται εργαστηριακές δοκιμές ώστε να ρυθμίζεται η τελική ποσότητα SO2 που παραμένει στο προϊόν και να βρίσκονται τα προϊόντα εντός των επιθυμητών ορίων, αφού η στοιχειομετρικά υπολογισμένη ποσότητα οξειδωτικού (π.χ., Η2Ο2) δεν λειτουργεί λόγω της παρουσίας αντιοξειδωτικών ενώσεων στο ΥΤΚ. Βελτιώσεις στη θέμα αυτό μπορεί επίσης να αφορούν εφαρμογή τεχνικών αποστείρωσης του ΥΤΚ πριν την εκχύλιση και συμπύκνωση για αποφυγή της θείωσης των γλευκών. Συνολικά, ανιχνεύθηκαν με SPME GC-MS 144 πτητικές ενώσεις στα σιρόπια. Από αυτές, οι καρβονυλικές βρέθηκαν σε υψηλότερα επίπεδα στα σιρόπια σε σχέση το ΥΤΚ, με κυριότερες τις 2- και 3-μεθυλοβουτανάλη, ακετοΐνη, φουρφουράλη, 5-μεθυλο-2-φουρφουράλη, και 1-αιθυλο-2-φορμυλοπυρρόλη. Γενικά, οι περισσότερες από τις ενώσεις που ταυτοποιήθηκαν είτε παράγονται κατά την αφυδάτωση των σταφίδων ως προϊόντα οξείδωσης των λιπιδίων ή ως προϊόντα της αντίδρασης Maillard (καρβονυλικές ενώσεις, φουράνια, φουρφουρυλικές ενώσεις). Ωστόσο, σε κανένα από τα σιρόπια δεν ανιχνεύθηκε υδροξυμεθυλοφουρφουράλη (HMF) ή ακρυλαμίδιο, καθώς για την παρασκευή τους πραγματοποιήθηκε συμπύκνωση υπό κενό σε χαμηλή θερμοκρασία (45οC). Από τις οργανοληπτικές δοκιμές, τις μικροβιολογικές αναλύσεις, και τα επίπεδα πτητικής οξύτητας, φάνηκε πως τα σιρόπια από ΥΤΚ (με τις προτεινόμενες μεθόδους παρασκευής) είναι προϊόντα πολύ καλής ποιότητας, τα οποία διατηρούνται εύκολα, ενώ κατά τη διάρκεια παρασκευής και αποθήκευσής τους δεν εμφανίζουν μικροβιακές αλλοιώσεις. Γενικά περιγράφηκαν ως προϊόντα με έντονη επίγευση, καλή και όχι ιδιαίτερα έντονη οσμή, καλή γλυκόξινη γεύση ή παρόμοια με αυτή του μελιού, και χωρίς μεταλλική αίσθηση. Το χρώμα τους ήταν παρόμοιο με του μελιού για τα καστανά, και χρυσοκίτρινο για τα ξανθά σιρόπια. Τέλος, τα σιρόπια από ΥΤΚ, μπορούν να θεωρηθούν προϊόντα με υψηλή διατροφική αξία και κατάλληλα (με μέτρο) για διαβητικούς καθώς περιέχουν μεγάλο ποσοστό φρουκτόζης και καθόλου σακχαρόζη. Παρασκευάστηκαν επίσης μαρμελάδες από το ΥΤΚ με/χωρίς προσθήκη πηκτίνης και με/χωρίς συντηρητικά. Οι μαρμελάδες είχαν σε γενικές γραμμές παρόμοια χαρακτηριστικά με μαρμελάδα σταφυλιού του εμπορίου που χρησιμοποιήθηκε για σύγκριση. Ορισμένες διαφορές μεταξύ τους οφείλονται στην διαφορετική πρώτη ύλη και τον διαφορετικό τρόπο παρασκευής τους. Όλες οι μαρμελάδες εμφάνισαν παρόμοιο φαινολικό περιεχόμενο (220-320 mg GAE/100 g, αθροιστικά υδατικού και οργανικού κλάσματος), ενώ η αντιοξειδωτική ικανότητα των μαρμελάδων ήταν 1,16-0,96 mg ΑΑΕ/g. Επίσης, ταυτοποιήθηκαν συνολικά 144 πτητικές ενώσεις με SPME GC-MS. Από αυτές, ορισμένες κατηγορίες όπως αλκοόλες, οργανικά οξέα, λακτόνες και υδρογονάνθρακες, ήταν κατά πολύ μειωμένες στη μαρμελάδα σε σχέση με την πρώτη ύλη (λόγω αραίωσης και απώλειας κατά το βρασμό). Όπως και στα σιρόπια, αυξημένα εμφανίστηκαν στις μαρμελάδες τα ποσοστά των καρβονυλικών ενώσεων (σχεδόν διπλάσια) και των τερπενίων (πιθανή υδρόλυση από τις δεσμευμένες μορφές τους). Από τις ενώσεις της αντίδρασης Maillard (εκτός από τις καρβονυλικές ενώσεις), ιδιαίτερα αυξημένο εμφανίστηκε στη μαρμελάδα το 2-ακετυλοφουράνιο. Πολύ μεγάλο ήταν επίσης το ποσοστό 2-οκτενάλης, ουσίας που υπάρχει στα σταφύλια και τις σταφίδες και είναι προϊόν της οξείδωσης των ακόρεστων λιπαρών οξέων από λιποξυγενάσες του σταφυλιού, αλλά και προϊόν της αντίδρασης Maillard. Επομένως δικαιολογείται η αυξημένη συγκέντρωσή της στη μαρμελάδα. Η διαφορές στο πτητικό προφίλ μεταξύ μαρμελάδων και σιροπιών εξαρτάται προφανώς από την διαφορετική θερμοκρασία και τον χρόνο της κατεργασίας. Από τις μικροβιολογικές αναλύσεις και τα επίπεδα πτητικής οξύτητας (0,044-0,066 %) φάνηκε πως οι μαρμελάδες είναι προϊόντα διατηρήσιμα. Το φαινολικό περιεχόμενό τους κυμάνθηκε στα ίδια επίπεδα με αυτά που αναφέρει η βιβλιογραφία, ενώ δεν περιείχαν ΗMF παρόλο που παρασκευάστηκαν με εντονότερη θερμική κατεργασία σε σχέση με τα σιρόπια. Γευστικά, αλλά και οπτικά, οι μαρμελάδες ήταν ευχάριστες και έγιναν καλά αποδεκτές από τους δοκιμαστές. Επίσης, φάνηκε πως δεν είναι απαραίτητη η προσθήκη συντηρητικών ή πηκτίνης καθώς οι μαρμελάδές χωρίς πρόσθετα είχαν παρόμοια υφή και διατηρησιμότητα με τις μαρμελάδες στις οποίες προστέθηκαν τα παραπάνω. Τέλος, μπορούν να θεωρηθούν προϊόντα με υψηλή διατροφική αξία και κατάλληλα για διαβητικούς (με μέτρο) καθώς δεν περιέχουν πρόσθετη ζάχαρη και η γλυκύτητά τους οφείλεται κατά το ήμισυ στη φρουκτόζη. Στη συνέχεια της διατριβής, μελετήθηκε η παραγωγή ξηρού οίνου από εκχυλίσματα ΥΤΚ σε διάφορες θερμοκρασίες (4, 10, 15, 22οC), με τη χρήση ελεύθερων και ακινητοποιημένων κυττάρων του κρυοανθεκτικού και αλκοολοανθεκτικό στελέχους Saccharomyces cerevisiae AXAZ-1, το οποίο έχει μελετηθεί εκτενώς για εφαρμογές σε ποτά, τρόφιμα και βιοκαύσιμα. Η χρήση τεχνικών ακινητοποίησης κυττάρων μπορεί να προσφέρει πλεονεκτήματα σε σύγκριση με συστήματα ελεύθερων κυττάρων, όπως αυξημένη παραγωγικότητα, αυξημένη βιωσιμότητα και λειτουργική σταθερότητα, δυνατότητα ζύμωσης σε χαμηλή θερμοκρασία, και βελτιωμένη ποιότητα προϊόντος. Συγκεκριμένα, ο συνδυασμός ακινητοποίησης κυττάρων και η ζύμωση σε εξαιρετικά χαμηλή θερμοκρασία συμβάλει στη βελτίωση της ποιότητας των προϊόντων τόσο της αλκοολικής όσο και της οξικής ζύμωσης, όπως έχει φανεί από πληθώρα προηγούμενων μελετών. Η θερμοκρασία επηρέασε επίσης σημαντικά τον χρόνο ζύμωσης των ξηρών οίνων, ενώ δεν επηρέασε σημαντικά τα επίπεδα αζύμωτου σακχάρου, αιθανόλης, ολικής και πτητικής οξύτητας. Ο βιοκαταλύτης διατήρησε τη λειτουργική του σταθερότητα για περισσότερο από 6 εβδομάδες, ακόμη και στους 4oC. Οι οίνοι ήταν πιο διαυγείς από εκείνους που παρασκευάστηκαν με ελεύθερα κύτταρα, περιείχαν ίχνη αζύμωτου σακχάρου και η περιεκτικότητα σε αιθανόλη κυμάνθηκε στα 11,2%. Επίσης, δεν ανιχνεύθηκε μεθανόλη, που σημαίνει ότι η πηκτινομεθυλεστεράση του σταφυλιού είχε απενεργοποιηθεί κατά την αφυδάτωση των σταφίδων. Η μη ύπαρξη μεθανόλης καθιστά τους ξηρούς οίνους ιδανική πρώτη ύλη για την παραγωγή αποσταγμάτων, που μπορεί να αποφέρει ακόμα μεγαλύτερη προστιθέμενη αξία στο ΥΤΚ. Επομένως, μελλοντική μελέτη της παραγωγής αποσταγμάτων από το ΥΤΚ (τύπου «μπράντι σταφίδας») προτείνεται εντόνως. Το pΗ των ξηρών οίνων που παράχθηκαν με ακινητοποιημένα κύτταρα ήταν ελαφρώς χαμηλότερο, αν και η ολική και η πτητική οξύτητα ήταν ελαφρώς υψηλότερες στους οίνους που παρασκευάστηκαν με ελεύθερα κύτταρα. Ωστόσο, οι παρατηρούμενες μεταβολές ήταν στατιστικά ασήμαντες. Το ίδιο παρατηρήθηκε για τα επιμέρους οργανικά οξέα, εκτός του ηλεκτρικού, το οποίο ήταν πιο άφθονο στους οίνους που παράχθηκαν με ακινητοποιημένα κύτταρα. Το φαινολικό περιεχόμενο ήταν σε ελαφρώς χαμηλότερα επίπεδα σε σχέση με τους περισσότερους λευκούς οίνους. Επομένως, προτείνεται βελτιστοποίηση της εκχύλισης του ΥΤΚ για την παραλαβή περισσότερων φαινολικών συστατικών. Επίσης, μειώθηκε σε χαμηλότερες θερμοκρασίες ζύμωσης με τη χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων. Αυτό μπορεί να αποτελεί μειονέκτημα όσον αφορά την διατροφική αξία του οίνου, αλλά όχι απαραίτητα και τεχνολογικό μειονέκτημα δεδομένου ότι τα φαινολικά συστατικά επηρεάζουν τη γεύση, το άρωμα και τη διαύγεια των οίνων, και η τελική ποιότητα θα εξαρτηθεί από το σύνολο των πρακτικών οινοποίησης που θα εφαρμοστούν (θερμοκρασία ζύμωσης, χρήση ή μη ακινητοποιημένων κυττάρων, κατεργασίες διαύγασης, και άλλες μεταζυμωτικές κατεργασίες). Τα επιμέρους φαινολικά συστατικά στους οίνους που παρασκευάστηκαν με τη χρήση ακινητοποιημένων κύτταρων, και προσδιορίστηκαν με RP-HPLC, ήταν το γαλλικό, το βανιλλικό, το π-κουμαρικό και το καφεϊκό οξύ. Παρόμοια μείωση σε χαμηλότερες θερμοκρασίες ζύμωσης παρατηρήθηκε και για αυτές τις ενώσεις. Το βανιλλικό οξύ ήταν το κύριο φαινολικό οξύ στους οίνους που παρασκευάστηκαν στους 22οC.Στους ξηρούς οίνους ταυτοποιήθηκαν συνολικά 160 πτητικές ενώσεις. Συγκεκριμένα οι οίνοι περιείχαν υψηλότερα επίπεδα τερπενίων από το ΥΤΚ (που υποδεικνύει υδρόλυση συνδεδεμένων μορφών τους στους οίνους), και μεγάλο αριθμό πτητικών ενώσεων (κυρίως εστέρες) που προέρχονται από τη ζύμωση. Η επίδραση της ακινητοποίησης του ζυμομύκητα στο πτητικό προφίλ των οίνων ήταν η αναμενόμενη, όπως αναφέρεται και σε προηγούμενες μελέτες (υψηλότερα επίπεδα εστέρων σε σχέση με τα ελεύθερα κύτταρα, και σε χαμηλότερη θερμοκρασία ζύμωσης). Ο οίνος που παρασκευάστηκε με ακινητοποιημένα κύτταρα είχε επίσης μεγαλύτερη διαύγεια και χωρίς την παρουσία θολωμάτων. Επίσης, η ένταση του χρώματος χαρακτηρίστηκε από ωχρή έως μέτρια, και η απόχρωση ήταν ανοιχτή, του κεχριμπαριού. Όσο αναφορά το άρωμα, παρατηρήθηκε μέτρια ένταση και στους δύο οίνους. Γενικά οι οίνοι χαρακτηρίστηκαν ως ξηροί, με χαμηλή τανίνη, ελαφρύ σώμα, και μέτριας έντασης γεύση, οξύτητα και επίγευση. Η αίσθηση της αλκοόλης ήταν μέτρια για τους δύο οίνους που δοκιμάστηκαν.Παρασκευάστηκαν επίσης τρεις τύποι γλυκών οίνων με αλκοόλη ~15,5% v/v. Ένας οίνος παρασκευάστηκε με προσθήκη πόσιμης αιθανόλης για παύση της αλκοολικής ζύμωσης. Οι άλλοι δύο οίνοι παρασκευάστηκαν με πλήρη ζύμωση και στη συνέχεια προσθήκη ΥΤΚ ή προσθήκη καστανού σιροπιού από ΥΤΚ για την επίτευξη της επιθυμητής γλυκύτητας. Τα περισσότερα χαρακτηριστικά τους ήταν παρόμοια με εκείνα γλυκών κρασιών του εμπορίου. Η ολική οξύτητα κυμάνθηκε περίπου στα 7 g τρυγικού οξέος/l με μεγαλύτερη οξύτητα να παρουσιάζουν οι οίνοι στους οποίους προστέθηκε ΥΤΚ ή σιρόπι. Η δε πτητική οξύτητα και το pH των οίνων ήταν χαμηλά και για τους τρεις οίνους. Τα κύρια οργανικά οξέα των οίνων ήταν το τρυγικό και μηλικό οξύ, ενώ περιείχαν πολύ μικρότερες συγκεντρώσεις κιτρικού, οξικού και ηλεκτρικού οξέος. Όλοι οι οίνοι εμφάνισαν παρόμοιες τιμές φαινολικού περιεχομένου (244-325 mg GAE/l) και αντιοξειδωτικής ικανότητας. Στους γλυκούς οίνους ταυτοποιήθηκαν 160 πτητικές ενώσεις, όπως και στους ξηρούς. Σχετικά με την εμφάνιση, και για τους τρεις οίνους παρατηρήθηκε υψηλή διαύγεια, χωρίς ιζήματα. Η ένταση των χρωμάτων χαρακτηρίστηκε ως έντονη με αποχρώσεις του ανοιχτού καφέ-πορτοκαλί έως σκούρου-κεχριμπαρί χρώματος. Περιγράφηκαν γενικά ως οίνοι υψηλής γλυκύτητας, μέτριας οξύτητας, με έντονη γεύση σταφίδας, και επίγευση αρκετή αλλά όχι μακρά. Η αίσθηση της αλκοόλης ήταν μέτρια έως υψηλή και για τα τρία κρασιά που δοκιμάστηκαν. Συμπερασματικά, οι γλυκοί οίνοι που παρασκευάστηκαν με τις προτεινόμενες μεθόδους, ομοιάζουν με τους επιτραπέζιους γλυκούς οίνους με μόνη διαφορά τα χαμηλότερα επίπεδα φαινολικού περιεχομένου και αντιοξειδωτικής ικανότητας, σύμφωνα με τη διαθέσιμη βιβλιογραφία, αφού δεν πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις σε οίνους του εμπορίου με τις αναλυτικές τεχνικές που εφαρμόστηκαν στη διατριβή. Οι προτεινόμενες μέθοδοι όμως οδήγησαν σε οίνους πολύ καλής οργανοληπτικής ποιότητας, που μπορούν όλοι να τυποποιηθούν και να καταναλωθούν ως γευστικά ηδύποτα από σταφίδα, ενώ παράλληλα μπορούν να μειώσουν σημαντικά το κόστος παραγωγής καθώς δεν απαιτείται προσθήκη πόσιμης αιθανόλης. Στη συνέχεια της διατριβής πραγματοποιήθηκε παραγωγή ξυδιού με οξική ζύμωση γλυκού οίνου από ΥΤΚ με τη χρήση ελεύθερων και ακινητοποιημένων κυττάρων άγριας μαγιάς, αλλά και μικτής καλλιέργειας επιλεγμένων οξικών βακτηρίων. Συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε ένα βακτήριο «γρήγορης εκκίνησης» (Acetobacter aceti DSM 3508) και ένα βακτήριο με υψηλή αντοχή στο οξικό οξύ (Komagataeibacter europareus DSM 6160). Παράλληλα μελετήθηκε των οξοποιητικών καλλιεργειών μετά από παραμονή σε χαμηλή θερμοκρασία για 2 μήνες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι σε όλες τις περιπτώσεις ο χρόνος οξοποίησης μειώνεται ελαφρώς από παρτίδα σε παρτίδα (προσαρμογή των κυττάρων και λειτουργική σταθερότητα του συστήματος), και σημαντικά με τη χρήση ακινητοποιημένων κυττάρων (αύξηση παραγωγικότητας-μείωση κόστους διεργασίας). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με προηγούμενες μελέτες όσον αφορά την αύξηση της ταχύτητας και παραγωγικότητας που προκαλεί η ακινητοποίηση κυττάρων σε άλλες ζυμωτικές διεργασίες, όπως η αλκοολική και η γαλακτική ζύμωση. Η δε παραμονή της οξικής καλλιέργειας σε χαμηλή θερμοκρασία στο ψυγείο δεν την απενεργοποιεί πλήρως, όμως αυξάνει τον χρόνο της επόμενης οξοποίησης. Η χρήση της μικτής καλλιέργειας επιλεγμένων οξικών βακτηρίων, είχε επίσης ως αποτέλεσμα τη μείωση του χρόνου οξοποίησης, σε σχέση με την άγρια μαγιά οξοποίησης, εξασφαλίζοντας έτσι καλύτερες αποδόσεις και καλύτερη εξέλιξη των ζυμώσεων. Το φαινολικό περιεχόμενο και η αντιοξειδωτική ικανότητα ήταν υψηλότερα στην περίπτωση του ξυδιού που παρασκευάστηκε με ελεύθερα κύτταρα (λόγω προσρόφησης φαινολικών ενώσεων στον φορέα ακινητοποίησης), ωστόσο κυμάνθηκε σε παρόμοια επίπεδα με τα εμπορικά προϊόντα ξυδιού από λευκό κρασί. Συγκρίνοντας τα διάφορα προϊόντα ξυδιού μεταξύ τους όσον αφορά το πτητικό προφίλ, παρατηρείται πως μεγαλύτερα ποσοστά εστέρων περιείχαν τα προϊόντα που παρασκευάστηκαν με ακινητοποιημένα κύτταρα. Επίσης, οι εστέρες στα προϊόντα ήταν κατά 8 φορές αυξημένοι σε σχέση με το ΥΤΚ. Μεγαλύτερα ποσοστά αλκοολών περιείχε το ξύδι που παρασκευάστηκε με ελεύθερα κύτταρα της άγριας μαγιάς. Τα ποσοστά οργανικών οξέων ήταν παρόμοια στα περισσότερα δείγματα, εκτός του ξυδιού που παρασκευάστηκε με ελεύθερα κύτταρα των επιλεγμένων οξικών βακτηρίων. Επίσης, τα προϊόντα παρουσίασαν μειωμένα ποσοστά τερπενίων, λακτονών και καρβονυλικών ενώσεων σε σχέση με το ΥΤΚ.Τα αποτελέσματα συγκεντρωτικά είναι ενθαρρυντικά για την παραγωγή ξυδιού από το ΥΤΚ με ακινητοποιημένα κύτταρα επιλεγμένων οξικών βακτηρίων, με την προϋπόθεση ότι η εφαρμογή στη βιομηχανία θα εμπλέκει εξειδικευμένο προσωπικό, καθώς και τις κατάλληλες μεταζυμωτικές κατεργασίες. Στην παρούσα διατριβή προτείνεται επίσης η χρήση του ΥΤΚ ως πρώτη ύλη για την παραγωγή βακτηριακής κυτταρίνης (ΒΚ), η οποία αν και προσεγγίζεται ως υλικό με ποικίλες εφαρμογές (εξ’ ου και μελετήθηκαν οι φυσικοχημικές ιδιότητες υφής της), μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί ως τρόφιμο υψηλής διατροφικής αξίας (πλούσιο σε διαιτητικές ίνες/πριβιοτικό τρόφιμο). Συγκεκριμένα, από τα αποτελέσματα της μελέτης βελτιστοποίησης παραγωγής ΒΚ με τον μικροοργανισμό Komagataeibacter sucrofermentans DSM 15973 σε εκχυλίσματα ΥΤΚ (ΕΥΤΚ) (με Μεθοδολογία Επιφανειακής Απόκρισης με βάση τον Σύνθετο Κεντρικό Σχεδιασμό), προκύπτει ότι η προσθήκη πηγών-Ν στο ΕΥΤΚ είναι απαραίτητη για βέλτιστη απόδοση σε ΒΚ. Σημαντικό ρόλο στην απόδοση έπαιξαν επίσης το pH και η θερμοκρασία επώασης. Ο ιδανικός συνδυασμός για τη βέλτιστη απόδοση ΒΚ σε ΕΥΤΚ ήταν 28,07οC, pH 6,42, συγκέντρωση σακχάρου 46,24 g/l και προσθήκη δύο πηγών-Ν (πεπτόνη και yeast extract), αποδίδοντας 18,40,6 g/l ΒΚ. Χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα μίγμα ΕΥΤΚ/τυρογάλακτος, ο ιδανικός συνδυασμός για τη βέλτιστη απόδοση ΒΚ ήταν pH 6,36 και προσθήκη yeast extract 1,7%, οδηγώντας σε παραγωγή 18,9±0,7 g/l ΒΚ. Επομένως το τυρόγαλα μπορεί να αξιοποιηθεί από τον Κ. sucrofermentans ως φθηνή πηγή-Ν και άλλων μικροθρεπτικών συστατικών για την παραγωγή ΒΚ. Επίσης, ο τρόπος ξήρανσης της ΒΚ μετά την παραγωγή της (θερμική, freeze-drying) οδηγεί σε διάφορες μορφές και υφές του προϊόντος (διαυγές φιλμ με πολυμερική εμφάνιση και υφή, με μεγάλη διαπερατότητα και ολκιμότητα, ή υφή παρόμοια με χαρτιού ή του βαμβακιού). Η φυσικοχημική ανάλυση υφής (ποροσιμετρία, SEM, FT-IR, XRD, TGA/TDA), έδειξε ότι η ΒΚ αποτελείται από διασταυρωμένες, αλλά με σχετικά υψηλό βαθμό προσανατολισμού ίνες (με πάχος στη νανοκλίμακα), που δημιουργούν μία δομή πυκνού τρισδιάστατου δικτύου, ενώ ο όγκος των πόρων της είναι παρόμοιος ή μεγαλύτερος από άλλα είδη φυτικής απολιγνινοποιημένης κυτταρίνης. Τέλος, τα ΕΥΤΚ χαμηλότερης πυκνότητας που απομένουν από την παραγωγή των παραπάνω προϊόντων, χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή μικροβιακής βιομάζας. Συγκεκριμένα μελετήθηκε η παραγωγή μαγιάς αρτοποιίας ή οινοποίησης (S. cerevisiae). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έντονη παροχή αέρα και η προσθήκη πηγής-Ν είναι απαραίτητες για την αύξηση της απόδοσης παραγωγής της βιομάζας στα ΕΥΤΚ. Η δε προσθήκη θρεπτικών συμπληρωμάτων Ν, P, S και Mg (υπό μορφή ανόργανων αλάτων τους), περαιτέρω αυξάνουν την απόδοση. Η μέγιστη απόδοση κυτταρικής βιομάζας που επιτεύχθηκε ήταν 45,0±1,3 g/l και 40,9±2,5 g/l ΕΥΤΚ, μαγιάς αρτοποιίας και S. cerevisiaie AXAZ-1, αντίστοιχα. Η βιωσιμότητα της παραγόμενης μαγιάς αρτοποιίας εξετάστηκε σε διάστημα 3 μηνών και βρέθηκε ικανοποιητική, ενώ η σύστασή της ήταν παρόμοια με της μαγιάς αρτοποιίας του εμπορίου που χρησιμοποιήθηκε ως εμβόλιο. Η τεχνοοικονομική ανάλυση για μια ολοκληρωμένη βιομηχανική διεργασία παραγωγής οίνου (με ακινητοποιημένα κύτταρα) (780 m3/έτος) και μαγιάς αρτοποιίας (24,6 tn/έτος) με πρώτη ύλη το ΥΤΚ (7,5 m3/ημέρα, για 120 ημέρες/έτος) έδειξε ότι η επένδυση είναι ρεαλιστική και συμφέρουσα. Για μηδενική Καθαρή Παρούσα Αξία (NPV), η Ελάχιστη Τιμή Πώλησης (MSP) εκτιμάται σε 7,75 $/tn αθροιστικά για τον ξηρό οίνο και τη μαγιά αρτοποιίας, δηλαδή 0,08 $/kg προϊόντος. Στο τέλος του πονήματος, παρατίθενται τα συμπεράσματα επί των αποτελεσμάτων της διατριβής, από τα οποία προκύπτει ότι το ΥΤΚ αποτελεί μια πρώτη ύλη με υψηλή διατροφική αξία, κατάλληλη για χρήση ως πρώτη ύλη για πληθώρα προϊόντων όπως οίνοι, σιρόπια, μαρμελάδες, ξύδι, μικροβιακοί μεταβολίτες και μικροβιακή βιομάζα. Η τεχνική της ακινητοποίησης κυττάρων βοήθησε σε κάθε περίπτωση τόσο στην ποιότητα των τελικών προϊόντων ζύμωσης όσο και στην αποδοτικότητα των διεργασιών. Οι νέες μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή γλυκών οίνων και γλυκαντικών υλών είναι κατάλληλες για την παραγωγή προϊόντων καλής ποιότητας και με χαμηλό κόστος παραγωγής. Τέλος, προτείνονται μελλοντικές δράσεις για την διόρθωση της ποιότητας των προτεινομένων προϊόντων και των μεθόδων παρασκευής τους, την παραγωγή επιπλέον προϊόντων από το ΥΤΚ, και την αξιολόγηση της πιθανής βιομηχανικής τους εφαρμογής, με σκοπό την αξιοποίηση όλης της ποσότητας του ΥΤΚ και την παραγωγή προστιθέμενης αξίας, υπό την ιδέα του βιοδιυλιστηρίου.