Metabolic processes and ecological adaptations of phytoplankton in oligotrophic environments: a theoretical and experimental approach

Abstract

The present thesis investigates two aspects of phytoplankton ecophysiology, which are particularly important in oligotrophic aquatic ecosystems. The first aspect is related to the mechanism of excretion of dissolved organic matter by photosynthetic cells, under varying nutrient availability conditions. The second aspect refers to mixotrophy in pigmented nanoflagellates (PNF) which is defined as the combination of autotrophy through photosynthesis (phototrophy) and heterotrophy through phagocytosis of bacteria (phagotrophy). The results of the present study emerge from the combination of theoretical and experimental approaches. In order to better understand the processes of dissolved organic matter (DOM) release by photosynthetic cells under nutrient-replete and nutrient-limited conditions, a model based on Dynamic Energy Budget (DEB) theory is developed. In the context of DEB theory, two alternative pathways of DOM release emerge from the theory; one relates to growth and lysis of the cells and one to rejection of unprocessed substrates due to stoichiometric constraints. These pathways represent the two conceptual mechanisms of DOM release, which are the passive diffusion and active exudation, respectively. The relative contribution of the two mechanisms to DOM excretion depends on nutrient availability and affects the quality of produced DOM in terms of elemental and molecular composition and size fractionation,which, in turn, may have implications for the bioavailability of the produced DOM to bacteria. Focusing on mixotrophy among PNF, a general modelling framework is developed for describing the nutritional strategies in four types of mixotrophic PNF. The resulting mathematical expressions are incorporated in the aforementioned DEB model for photosynthetic cells. The resulting models describe explicitly, for the first time, the functional diversity of the PNF assemblage taking into account the dynamic interaction of phototrophy and phagotrophy within the four types of PNF. Simulations suggest that the growth dynamics of the four types of PNF are affected differently by the availability of resources (light, dissolved inorganic nutrients and bacteria). A comparison of the rates of organic carbon production and prey consumption by the various PNF types shows that their net ecosystem role, as producers or consumers, depends on the mixotrophic strategy and it can vary as a function of the prevailing environmental conditions. Moreover, in the present thesis, an in-depth investigation of mixotrophy among PNFin the ultra-oligotrophic, phosphorus (P)-limited Eastern Mediterranean Sea (EMS) is performed, employing a two-phase experimental study that combined both field and laboratory nanoflagellates grazing experiments. During the field experiments, the abundance, and grazing effect of pigmented (PNF) and heterotrophic (HNF) nanoflagellates on prokaryotic picoplankton stock (i.e., heterotrophic bacteria (HB) and Synechococcus) were assessed in April 2016 at four stations in the NW Levantine sea and at two selected depths representing the surface and the deeper (deep chlorophyll maximum) euphotic layer. Results showed that HNF dominated prokaryotic picoplankton consumption in the surface layer, whereas, PNF were the dominant grazers of prokaryotic picoplankton in the deeper euphotic layer. A negative relationship between phosphate concentration and ingestion rate of PNF on prokaryotic picoplankton was observed. Subsequent microcosm experiments were performed with nutrient depleted water from the Cretan Sea (EMS) during the late stratified season, in order to assess the responses of heterotrophic and pigmented nanoflagellates, in terms of bacterial grazing, when relaxing the observed P-limitation. In accordance with the results of the field experiments, PNF ingestion rate of heterotrophic bacteria (HB) was significantly reduced in the P-amended treatment, whereas for HNF this rates remained unaffected by P-addition. PNF dominated bacterivory in the unperturbed (control) bottles, whereas, in the P amended treatment HNF and PNF contributed equally to total bacterivory. The experimental results obtained in the present study emphasize the significant and P-dependent role of PNF as consumers of HB in the EMS. The results of the theoretical and experimental work undertaken in the present thesis are synthesized into an idealized microbial food web model. This theoretical analysis aims to further explore qualitatively the effect of phosphorus availability on the trophic interactions and physiological processes of heterotrophic bacteria, heterotrophic and pigmented nanoflagellates in the EMS. The model simulations suggest alternating pathways of P transfer through the microbial food web components during P-replete and P-limited conditions. Pigmented nanoflagellates hold a key role in P transfer through the trophic "by-pass" pathway sensu Thingstad et al. (2005) [Thingstad et al., 2005. Science, 309:1068-1071] under P-limited conditions, whereas the relative role of heterotrophic nanoflagellates in this pathway is more prominent at P-replete conditions. The complicated interactions between PNF and HB in the EMS could be conceptually described as an alternative microbial loop, in respect to the established paradigm involving heterotrophic bacteria and HNF. In this alternative microbial loop, PNF have the functional role of DOM primary producers, mainly through the active exudation mechanism, and, at the same time, share with HNF the functional role of bacterial consumers via mixotrophy. This alternative microbial loop in the oligotrophic system of the EMS operates in a phosphorus-dependent way. The results of this thesis emphasize the importance of the adaptive physiology of photosynthetic protists for the functioning of oligotrophic systems and the importance of taking into account this adaptive behaviour in biogeochemical models in order to predict the response of oligotrophic systems to environmental changes.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνώνται δύο πτυχές της οικοφυσιολογίας του φυτοπλαγκτού, οι οποίες είναι ιδιαίτερα σημαντικές στα ολιγοτροφικά υδάτινα οικοσυστήματα. Η πρώτη σχετίζεται με το μηχανισμό της απέκκρισης διαλυτού οργανικού υλικού από τα φωτοσυνθετικά κύτταρα σε μεταβαλλόμενες συνθήκες διαθεσιμότητας θρεπτικών. H δεύτερη αφορά τη μικτοτροφία στα φωτοσυνθετικά νανομαστιγωτά, δηλαδή το συνδυασμό αυτοτροφίας μέσω της φωτοσύνθεσης (φωτοτροφία) και ετεροτροφίας μέσω της φαγοκυττάρωσης βακτηρίων (φαγοτροφία). Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης προκύπτουν από το συνδυασμό θεωρητικών και πειραματικών προσεγγίσεων. Με σκοπό τη διερεύνηση και κατανόηση της διαδικασίας της απέκκρισης διαλυτού οργανικού υλικού από τα φωτοσυνθετικά κύτταρα σε συνθήκες υψηλής και χαμηλής διαθεσιμότητας θρεπτικών αναπτύχθηκε ένα μαθηματικό μοντέλο βασισμένο στη θεωρία Δυναμικού Ενεργειακού Ισοζυγίου (Dynamic Energy Budget, DEB). Στα πλαίσια της θεωρίας DEB προκύπτουν δύο εναλλακτικά μονοπάτια απέκκρισης οργανικού υλικού. Το πρώτο σχετίζεται με την αύξηση και τη λύση των κυττάρων και το δεύτερο με την απόρριψη υποστρωμάτων λόγω στοιχειομετρικών περιορισμών. Τα δύο αυτά μονοπάτια αντιστοιχούν στους δύο θεωρητικούς μηχανισμούς απέκκρισης οργανικού υλικού, οι οποίοι είναι η παθητική διάχυση και η ενεργός απέκκριση. Η σχετική συνεισφορά των δύο μηχανισμών στην απέκκριση του οργανικού υλικού από τα φωτοσυνθετικά κύτταρα εξαρτάται από τη διαθεσιμότητα των θρεπτικών και επηρεάζει ποιοτικά το παραγόμενο διαλυτό οργανικό υλικό, σε ότι αφορά τη στοιχειακή και μοριακή σύσταση αλλά και το μοριακό βάρος. Οι ιδιότητες αυτές με τη σειρά τους μπορεί να έχουν σημαντικές επιπτώσεις στη βιοδιαθεσιμότητα του παραγόμενου διαλυτού οργανικού υλικού για τα βακτήρια. Εστιάζοντας στη μικτοτροφία στα φωτοσυνθετικά νανομαστιγωτά, αναπτύχθηκε ένα πλαίσιο μοντελοποίησης για τις διαφορετικές στρατηγικές θρέψης των μικτότροφων φωτοσυνθετικών νανομαστιγωτών. Τα μοντέλα που προέκυψαν περιγράφουν, για πρώτη φορά, τη λειτουργική ποικιλότητα της ομάδας των φωτοσυνθετικών νανομαστιγωτών, λαμβάνοντας υπόψη την δυναμική αλληλεπίδραση μεταξύ φωτοτροφίας και φαγοτροφίας σε τέσσερις διαφορετικούς τύπους μικτότροφων φωτοσυνθετικών νανομαστιγωτών. Οι προσομοιώσεις του μοντέλου υποδεικνύουν ότι η διαθεσιμότητα των φυσικών πόρων (φως, συγκέντρωση διαλυμένων ανόργανων θρεπτικών και βακτηρίων) επιδρά με διαφορετικό τρόπο στις δυναμικές των ρυθμών αύξησης των επιμέρους τύπων φωτοσυνθετικών νανομαστιγωτών. Παράλληλα, με βάση τις προσομοιώσεις του μοντέλου, η σύγκριση των ρυθμών παραγωγής οργανικού άνθρακα και κατανάλωσης βακτηρίων για τους τέσσερις τύπους φωτοσυνθετικών νανομαστιγωτών δείχνει ότι ο λειτουργικός τους ρόλος ως παραγωγοί ή καταναλωτές εξαρτάται από τον τύπο μικτοτροφίας και μπορεί να ποικίλει ως συνάρτηση των περιβαλλοντικών συνθηκών που επικρατούν την εκάστοτε χρονική στιγμή. Επίσης, στην παρούσα διατριβή, παρουσιάζεται, μια εμπεριστατωμένη μελέτη της μικτοτροφίας στα φωτοσυνθετικά νανομαστιγωτά στην υπερ-ολιγοτροφική και ιδιαίτερα φτωχή σε φώσφορο ανατολική Μεσόγειο θάλασσα. Η μελέτη αυτή περιλάμβανε πειράματα θήρευσης βακτηρίων από τα νανομαστιγωτά στο πεδίο αλλά και σε εργαστηριακές βιοδοκιμές. Όσον αφορά τα πειράματα πεδίου, καταγράφηκε η αφθονία και η επίδραση της θήρευσης των φωτοσυνθετικών και ετερότροφων νανομαστιγωτών στους πληθυσμούς του προκαρυωτικού πικοπλαγκτού (Synechococcus και ετερότροφα βακτήρια). Τα πειράματα έλαβαν χώρα τον Απρίλιο 2016 σε τέσσερις σταθμούς στη βορειοδυτική Λεβαντινή θάλασσα και σε δύο επιλεγμένα βάθη, τα οποία ήταν αντιπροσωπευτικά για το επιφανειακό και βαθύτερο (βαθυμέγιστο χλωροφύλλης) στρώμα της εύφωτης ζώνης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα ετερότροφα νανομαστιγωτά ήταν οι κυρίαρχοι θηρευτές του προκαρυωτικού πικοπλαγκτού στο επιφανειακό στρώμα, ενώ τα φωτοσυνθετικά νανομαστιγωτά ήταν οι κυρίαρχοι θηρευτές του προκαρυωτικού πικοπλαγκτού στο βαθύτερο στρώμα της εύφωτης ζώνης. Παρατηρήθηκε επίσης αρνητική συσχέτιση μεταξύ της συγκέντρωσης φωσφορικών αλάτων και του ρυθμού θήρευσης των φωτοσυνθετικών νανομαστιγωτών. Τα επακόλουθα πειράματα μικρόκοσμων πραγματοποιήθηκαν με δείγμα νερού από το Κρητικό πέλαγος, εξαιρετικά φτωχό σε θρεπτικά, κατά την περίοδο της ύστερης στρωμάτωσης της υδάτινης στήλης. Τα πειράματα μικρόκοσμων είχαν σκοπό να διερευνήσουν την απόκριση του ρυθμού θήρευσης των ετερότροφων και φωτοσυνθετικών νανομαστιγωτών στην αύξηση της διαθεσιμότητας του ανόργανου φωσφόρου. Επιβεβαιώνοντας τις ενδείξεις από τα πειράματα πεδίου, ο ρυθμός θήρευσης των φωτοσυνθετικών νανομαστιγωτών επί των ετερότροφων βακτηρίων μειώθηκε σημαντικά στους μικρόκοσμους όπου πραγματοποιήθηκε προσθήκη φωσφόρου, ενώ για τα ετερότροφα νανομαστιγωτά ο ρυθμός αυτός δεν επηρεάστηκε από την αύξηση της διαθεσιμότητας του φωσφόρου. Τα φωτοσυνθετικά νανομαστιγωτά ήταν οι κυρίαρχοι θηρευτές των βακτηρίων στους μικρόκοσμους όπου δεν πραγματοποιήθηκε προσθήκη φωσφόρου (μάρτυρες). Αντίθετα, στους μικρόκοσμους όπου πραγματοποιήθηκε προσθήκη φωσφόρου η συνεισφορά των φωτοσυνθετικών και ετερότροφων νανομαστιγωτών στη συνολική θήρευση επί των βακτηρίων ήταν παρόμοια. Τα αποτελέσματα των πειραματικών δοκιμών αναδεικνύουν το σημαντικό ρόλο των φωτοσυνθετικών νανομαστιγωτών ως καταναλωτών των βακτηρίων στην ανατολική Μεσόγειο, ο οποίος φαίνεται να εξαρτάται από τη διαθεσιμότητα του φωσφόρου. Τα αποτελέσματα της θεωρητικής και πειραματικής μελέτης συνδυάζονται σε ένα θεωρητικό μοντέλο που προσομοιάζει ένα απλοποιημένο τροφικό πλέγμα. Η θεωρητική αυτή ανάλυση έχει σκοπό την περαιτέρω ποιοτική διερεύνηση της επίδρασης της διαθεσιμότητας του φωσφόρου στις τροφικές αλληλεπιδράσεις και φυσιολογικές διεργασίες των ετερότροφων βακτηρίων και των ετερότροφων και φωτοσυνθετικών νανομαστιγωτών στην ανατολική Μεσόγειο. Οι προσομοιώσεις του μοντέλου υποδεικνύουν εναλλακτικά μονοπάτια μεταφοράς φωσφόρου διαμέσου του μικροβιακού τροφικού πλέγματος σε περιόδους υψηλής και χαμηλής διαθεσιμότητας φωσφόρου. Τα φωτοσυνθετικά νανομαστιγωτά κατέχουν σημαντικό ρόλο στη μεταφορά του φωσφόρου μέσω του μονοπατιού που ορίζεται ως «by-pass» από τους Thingstad et al. (2005) [Thingstad et al., 2005. Science, 309:1068-1071] σε συνθήκες περιορισμένης διαθεσιμότητας φωσφόρου ενώ ο σχετικός ρόλος των ετερότροφων νανομαστιγωτών ενισχύεται σε συνθήκες υψηλής διαθεσιμότητας φωσφόρου. Οι πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις μεταξύ φωτοσυνθετικών νανομαστιγωτών και ετερότροφων βακτηρίων στην ανατολική Μεσόγειο θάλασσα θα μπορούσαν να περιγραφούν εννοιολογικά ως ένας εναλλακτικός μικροβιακός βρόχος, ως προς το καθιερωμένο παράδειγμα που αναφέρεται στα ετερότροφα βακτήρια και τη θήρευση τους από τα ετερότροφα νανομαστιγωτά. Στον εναλλακτικό αυτό μικροβιακό βρόχο, τα φωτοσυνθετικά νανομαστιγωτά έχουν το λειτουργικό ρόλο των πρωτογενών παραγωγών διαλυτού οργανικού υλικού, κυρίως μέσω του μηχανισμού της ενεργούς απέκκρισης, ενώ ταυτόχρονα μοιράζονται με τα ετερότροφα νανομαστιγωτά το ρόλο των καταναλωτών των βακτηρίων μέσω της μικτοτροφίας. Η λειτουργία αυτού του εναλλακτικού μικροβιακού βρόχου στην υπερ-ολιγοτροφική Μεσόγειο θάλασσα εξαρτάται από τη διαθεσιμότητα του φωσφόρου. Τα αποτελέσματα της διδακτορικής αυτής διατριβής αναδεικνύουν τη σημασία της ευέλικτης φυσιολογίας των φωτοσυνθετικών μονοκύτταρων οργανισμών για τη λειτουργία των ολιγοτροφικών οικοσυστημάτων καθώς και την ανάγκη να λαμβάνεται υπόψη η προσαρμοστική αυτή συμπεριφορά στα βιογεωοχημικά μοντέλα έτσι ώστε να προβλεφθεί η απόκριση των ολιγοτροφικών οικοσυστημάτων στις περιβαλλοντικές αλλαγές.