Μελέτη της δράσης της ορμόνης που εκλύει την κορτικοτροπίνη (CRH) στην προ-/αντι-οξειδωτική ισορροπία του ενδοθηλίου παρουσία στεροειδών των γονάδων

Abstract

Atherosclerosis, a progressive arterial disorder, is characterized by chronic subclinical inflammation of the endothelium. Endothelial tissue integrity is particularly important for transmission of impulses in the arterial wall, regulation of vascular tone, blood pressure, etc, and its disruption has been implicated in the progression of atherosclerosis. Steroid hormones are implicated in the regulation of developmental mechanisms of atherosclerosis. Epidemiological studies indicate that estrogens have a protective effect on the endothelium, as evidenced by lower incidences of atherosclerosis in premenopausal women in comparison to their postmenopausal counterparts. However, the role of androgens in the regulation of the endothelium is not fully elucidated. It is thought that androgens may induce atherosclerosis. However, the current knowledge on how estrogens and androgens participate in the pathophysiology of chronic endothelial inflammation is limited. An important regulator of inflammation is Corticotropin releasing hormone (CRH), a well known stress neuropeptide. In general, CRH participates in inflammation by inducing the secretion of pro-inflammatory cytokines and production of cortizole. According to the literature, CRH is expressed locally in peripheral tissues and regulates cell function through its paracrine and autocrine effects. Our recent studies show that CRH is expressed on the endothelium and exerts a pro-oxidative effect, inducing its adaptation to local stress by modifying pro- and anti- oxidative mechanisms, that constitute important factors of inflammation. Given the limited data about the effect of estrogens and androgens on the homeostasis of cellular oxidative burden of the endothelium and that their effect on locally produced CRH effect is unknown, we designed this study in order to investigate the effect of steroid gonadals on: a) pro- and anti-oxidative mechanisms of macroendothelial cell line EAhy926, in normal conditions and b) the modification of the pro-oxidative role of CRH on the endothelium. The endothelial cell line EAhy926 was incubated for 2h with 17β-estradiol (E2), testosterone and dihydrotestosterone (DHT), alone or in combination with CRH. Our experimental protocol involved the assessment of intracellular reactive oxygen species (ROS) content, activities of endothelial synthase of NO (eNOS), catalase and superoxide dismutase (SOD), as well as the production of nitric oxide (NO), glutathione (GSH) and the Ratio GSH/GSH+GSSG of the macroendothelial cells. In order to evaluate the hormone’s mechanisms of action we used selective inhibitors of the estrogens and androgens receptors. Our findings indicate that E2, acting via ERα and ERβ, exerts a systemic anti-oxidative effect on the vascular endothelium, through regulation of pro- and anti-oxidative mechanisms, while it counterbalances the inhibitory effect of CRH on eNOS activity and NO production, resulting in decreased intracellular oxidative stress. On the contrary, androgens, through androgen receptor (AR), have a pro-oxidative effect, whereby they increase eNOS and SOD activities, as well as NO production, thereby inducing oxidative stress. Moreover, they abolish, similarly to estrogen, the inhibitory effect of CRH on eNOS activity, NO production, and its stimulatory effect on catalase activity enhancing the already increased oxidative stress. The above effects highlight the important role of steroid gonadals in the regulation of redox homeostasis of endothelial cells through modifications on pro- and anti-oxidative mechanisms.

Η αθηροσκλήρωση συνιστά μία εξελισσόμενη αρτηριακή διαταραχή που χαρακτηρίζεται από χρόνια υποκλινική φλεγμονή του ενδοθηλίου. Η ενδοθηλιακή ακεραιότητα είναι ιδιαιτέρως σημαντική για τη μεταβίβαση των απαραίτητων ερεθισμάτων στο αρτηριακό τοίχωμα, τη ρύθμιση του αγγειακού τόνου, την πίεση του αίματος, κλπ, και η διαταραχή αυτής της ακεραιότητας έχει συσχετισθεί με την ανάπτυξη της αθηροσκλήρωσης. Τα στεροειδή των γονάδων επηρεάζουν τους μηχανισμούς ανάπτυξης της αθηροσκλήρωσης. Επιδημιολογικές μελέτες υποδηλώνουν ότι τα οιστρογόνα ασκούν προστατευτική δράση στο ενδοθήλιο αφού, σε σύγκριση με προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες, η συχνότητα της αθηροσκλήρωσης αυξάνει μετά την εμμηνόπαυση. Ο ρόλος των ανδρογόνων στη λειτουργία του ενδοθηλίου δεν είναι πλήρως κατανοητός. Υπάρχει διάχυτη αλλά μη τεκμηριωμένη αντίληψη ότι τα ανδρογόνα προάγουν την αθηροσκλήρωση. Ωστόσο, οι γνώσεις μας για τη συμμετοχή ανδρογόνων και οιστρογόνων στην παθοφυσιολογία της χρόνιας φλεγμονής του ενδοθηλίου είναι περιορισμένες. Σημαντικός ρυθμιστικός παράγοντας του φαινομένου της φλεγμονής είναι η εκλυτική ορμόνη της κορτικοτροπίνης (CRH), γνωστό νευροπεπτίδιο του στρες. Συμμετέχει γενικά στη διαδικασία της φλεγμονής επάγοντας την έκκριση προ-φλεγμονωδών κυτοκινών και την παραγωγή της κορτιζόλης. Βιβλιογραφικά δεδομένα δείχνουν ότι η CRH εκφράζεται τοπικά σε περιφερικούς ιστούς και ασκεί ρυθμιστικό ρόλο στη λειτουργία των κυττάρων μέσω παρακρινικής και αυτοκρινικής δράσης. Πρόσφατες παρατηρήσεις μας έδειξαν ότι η CRH εκφράζεται στο ενδοθήλιο και ασκεί προ-οξειδωτική δράση, επάγοντας την προσαρμογή του στο τοπικό στρες μέσω της τροποποίησης των προ- και αντι-οξειδωτικών μηχανισμών, οι οποίοι αποτελούν σημαντικό στοιχείο της φλεγμονώδους διαδικασίας. Επειδή δεδομένα για την επίδραση οιστρογόνων και ανδρογόνων στην ομοιόσταση του κυτταρικού οξειδωτικού φορτίου στο ενδοθήλιο είναι περιορισμένα, και η επίδρασή τους στη δράση της τοπικά παραγόμενης CRH άγνωστη, σχεδιάσαμε την παρούσα μελέτη με στόχο τη διερεύνηση της επίδρασης των στεροειδών των γονάδων: α) στους προ- και αντι-οξειδωτικούς μηχανισμούς μακροενδοθηλιακών κυττάρων, της σειράς EAhy926, σε βασικές συνθήκες και β) στη μεταβολή του προ-οξειδωτικού ρόλου της CRH στο ενδοθήλιο. Στα μακροενδοθηλιακά κύτταρα τα οποία επωάσθηκαν για 2 ώρες παρουσία 17β-οιστραδιόλης (Ε2), Τεστοστερόνης και Διυδροτεστοστερόνης (DHT), μόνων ή σε συνδυασμό με CRH, μετρήθηκαν: α) η συγκέντρωση των ελευθέρων ριζών οξυγόνου (ROS), β) η ενεργότητα της ενδοθηλιακής συνθετάσης του ΝΟ (eNOS), της καταλάσης και της δισμουτάσης του υπεροξειδίου (SOD), γ) η συγκέντρωση του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) και της γλουταθειόνης (GSH) και υπολογίστηκε ο λόγος GSH/GSH+GSSG. Για την εκτίμηση του μηχανισμού δράσης των ορμονών χρησιμοποιήθηκαν εκλεκτικοί ανταγωνιστές των οιστρογονικών και ανδρογονικών υποδοχέων αντίστοιχα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι η Ε2, δρώντας μέσω των υποδοχέων ERα και ERβ, ασκεί συστηματική αντιοξειδωτική δράση στο αγγειακό ενδοθήλιο, μέσω επίδρασης στο σύνολο των προ- και αντι-οξειδωτικών μηχανισμών, ενώ εξουδετερώνει την ανασταλτική επίδραση της CRH στη δραστικότητα της eNOS και την παραγωγή του ΝΟ οδηγώντας σε ελάττωση του κυτταρικού οξειδωτικού φορτίου. Σε αντίθεση με τα οιστρογόνα, τα ανδρογόνα, δρώντας μέσω του ανδρογονικού υποδοχέα (AR), ασκούν προ-οξειδωτική δράση μέσω της αύξησης της δραστικότητας της eNOS, της παραγωγής ΝΟ, της δραστικότητας της SOD, και μείωση της δραστικότητας της καταλάσης, αυξάνοντας το ενδοκυτταρικό οξειδωτικό φορτίο. Παράλληλα, εξουδετερώνουν, όπως και τα οιστρογόνα, την ανασταλτική επίδραση της CRH στη δραστικότητα της eNOS και την παραγωγή του ΝΟ και επιπρόσθετα τη διεγερτική της επίδραση στη δραστικότητα της καταλάσης ενισχύοντας το ήδη αυξημένο ενδοκυτταρικό οξειδωτικό φορτίο. Οι ως άνω επιδράσεις τεκμηριώνουν τη σημαντική επίδραση των στεροειδών του φύλου στη ρύθμιση της οξειδοαναγωγικής ισορροπίας των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω της τροποποίησης των προ- και αντι-οξειδωτικών μηχανισμών.