Μελέτη του ιού του χλωρωτικού ικτέρου των κολοκυνθοειδών

Abstract

Criniviruses are associated with serious diseases of several crops but they are especially widespread in vegetables. The rapid increase and spread of whitefly populations has significantly accelerated the worldwide distribution of criniviruses and the emergence of new diseases associated with them. So far, five criniviruses have been detected in Greek fields, of which BPYV and CYSDV infect cucurbits, whereas in 2014, CCYV, a third crinivirus, was detected in cucurbit samples exhibiting yellowing symptoms.Due to the first report of CCYV in cucurbit crops in Greece, but also in Europe, field surveys were conducted to determine the presence of the virus in symptomatic cucurbits and alternative hosts among arable weed species. Results indicated the restricted spread of the virus in two islands (Rhodes, Crete) and it’s occurrence in 13 weed species, a fact that indicates that it has been established in alternative wild plant species. Another major goal was to provide insights on the interactions of CCYV and CYSDV in cucumber plants and their effect on transmission by the whitefly vector B. tabaci MED. RT-qPCR assays were developed in order to study the accumulation level of both viruses in single- and dually-infected cucumber plants. In mixed infections, both viruses were negatively affected, as accumulation levels were significantly decreased. When B. tabaci MED adults were placed in cucumber infected by both viruses, simultaneous transmission of both viruses was significantly raised (82%), whereas transmission of each virus separately was low. Moreover, a single whitefly transmitted both CYSDV and CCYV at 4,2%, and it retained both viruses for at least tree days. Furthermore, sequence analysis of three ORFs of CCYV revealed very low genetic diversity (<0,1%) among the Greek isolates. The full sequence of a Greek CCYV isolate was determined and used for the construction of an infectious cDNA clone. Finally, the putative RNA silencing suppression activity of several proteins encoded by both RNAs of CCYV was investigated and the RNA-1-encoded p22 was identifed as a functional suppressor of RNA silencing in both WT and 16c N. benthamiana plants. Comparison of the suppression activity of CCYV p22 with that of two other well-known crinivirus suppressors (CYSDV p25 and ToCV p22) revealed that CCYV p22 is a weaker suppressor of local RNA silencing than the other two proteins. Also, experiments on N. benthamiana line 16c showed that p22 does not interfere with cell-to-cell movement of the RNA silencing signal or with systemic silencing. To conclude, future research should focus on determining the exact mechanism by which this protein interacts with the RNA silencing pathway.

Οι ιοί του γένους Crinivirus αποτελούν σοβαρά παθογόνα κυρίως των κηπευτικών, στα οποία προκαλούν την ασθένεια του ικτέρου των φύλλων. Τα τελευταία χρόνια, οι περισσότεροι crini-ιοί εμφανίζουν ραγδαία γεωγραφική εξάπλωση, κυρίως λόγω της ταχείας πληθυσμιακής αύξησης και εξάπλωσης των αλευρωδών-φορέων τους. Στην Ελλάδα, έχουν ανιχνευτεί τουλάχιστον πέντε crini-ιοί, εκ των οποίων οι BPYV και CYSDV προσβάλλουν τα κολοκυνθοειδή, ενώ το 2014 ταυτοποιήθηκε και ένας τρίτος, ο CCYV. Η αναφορά του CCYV στην Ελλάδα αποτελεί και την πρώτη αναφορά του ιού στην Ευρώπη. O CCYV εμφανίζει περιορισμένη γεωγραφική εξάπλωση (Ρόδος, Κρήτη), ενώ ανιχνεύτηκε σε 13 διαφορετικά είδη ζιζανίων, γεγονός που υποδηλώνει ότι έχει εγκατασταθεί στην αυτοφυή βλάστηση. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η αλληλεπίδραση του CCYV με τον CYSDV, έναν συχνά απαντώμενο crini-ιό στον Ελλαδικό χώρο, σε φυτά αγγουριάς. Για το σκοπό αυτό, αναπτύχθηκαν τεχνικές RT-PCR πραγματικού χρόνου (real-time RT-PCR) για την αξιόπιστη ανίχνευση και ποσοτικοποίηση των δύο ιών. Όταν οι CCYV και CYSDV ιοί συνυπάρχουν σε φυτό αγγουριάς, μειώνεται σημαντικά η συγκέντρωσή τους. Όταν αλευρώδεις του είδους B. tabaci MED τοποθετούνταν σε φυτά μολυσμένα με τους CCYV και CYSDV, η ταυτόχρονη μετάδοσή τους αυξήθηκε σημαντικά (82%), ενώ η μετάδοση ενός εκ των δύο ήταν χαμηλή. Επίσης, βρέθηκε πως ένα άτομο αλευρώδη μεταδίδει ταυτόχρονα τους CYSDV και CCYV σε ποσοστό 4,2%, ενώ τους διατηρεί για διάστημα τουλάχιστον τριών ημερών. Ακολούθησε μοριακός χαρακτηρισμός τριών γονιδίων διαφόρων ελληνικών απομονώσεων του CCYV, ο οποίος ανέδειξε την περιορισμένη γενετική παραλλακτικότητά του (<0,1%). Ταυτόχρονα έγινε πλήρης μοριακός χαρακτηρισμός μίας ελληνικής απομόνωσης του CCYV, η οποία χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή μολυσματικού cDNA κλώνου. Τέλος, διερευνήθηκε η ικανότητα του CCYV να εκφράζει πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην καταστολή της σίγησης RNA, ενός σημαντικού αμυντικού μηχανισμού των φυτών έναντι στους ιούς. Ως πρωτεΐνη-καταστολέας ταυτοποιήθηκε η p22, η οποία κωδικοποιείται από το RNA-1 του ιού, και συγκρίθηκε η ενεργότητά της με άλλους ήδη χαρακτηρισμένους καταστολείς της σίγησης RNA άλλων crini-ιών, όπως η p25 του CYSDV και η p22 του ToCV. Αγροεμποτισμός σε φυτά N. benthamiana έδειξε ότι η p22 του CCYV αποτελεί ασθενέστερο καταστολέα της σίγησης RNA συγκριτικά με τις άλλες δύο πρωτεΐνες όσον αφορά στην ένταση και τη διάρκεια του φθορισμού της GFP. Επίσης, πειράματα σε φυτά N. benthamiana της σειράς 16c έδειξαν ότι η p22 δεν εμποδίζει τη διακυτταρική ή/και διασυστηματική μετακίνηση του σήματος της σίγησης, και πιθανώς δεν δεσμεύει dsRNAs. Για τη διαλεύκανση του ακριβούς τρόπου δράσης της p22 ως καταστολέα της σίγησης RNA είναι απαραίτητη η εφαρμογή περαιτέρω πειραματικών προσεγγίσεων.