Μελέτη του ρόλου των βλαστοκυττάρων στην αναγέννηση και την καρκινογένεση του ουροθηλίου στο ποντίκι

Abstract

The urothelium is a transitional epithelium that lines the urinary tract extending from the renal pelvis to the proximal urethra. It serves as a barrier preventing ions, solutes, water and pathogens from crossing into the bloodstream. It consists of three cell types, namely basal, intermediate, and superficial/ umbrella cells, which are arranged in relatively distinct cell layers. Normally, quiescent, it regenerates immediately upon acute injury, but the regeneration process has not been clarified. Although some reports indicate the existence of progenitor cells in the tissue, their identity and precise topology, as well as their role in tissue regeneration or carcinogenesis still remains elusive. Our results suggest that a minor subpopulation of basal cells characterized by the expression of keratin 14 represents stem cells of the tissue, able for both self renewal and production of all cell types of the urothelium, including the most differentiated cell types, during both natural and injury-induced regeneration. Moreover, these cells represent cells of origin of urothelial cancer, as indicated by employing an in vivo chemical carcinogenesis model. Recently published data from our laboratory support that the Notch signaling pathway, which mediates cell-cell communication regulating cellular processes and cell fate decisions in various tissues, acts as a tumor suppressor in the mouse urinary bladder, while mutations in Notch pathway components have been identified in human bladder cancer as well. However, the data presented herein highlight a major role for Notch in controlling epithelial integrity and bladder function in mice. We indicate that the genetic inactivation of Notch in mice leads to downregulation of cell-cell and cell-ECM interaction components including proteins previously implicated in interstitial cystitis/bladder pain syndrome (IC/BPS), structural defects and mucosal sloughing, inflammation and leaky urine-blood barrier. Molecular profiling of ailing mouse bladders showed similarities with IC/BPS patient tissue, which also presented low Notch pathway activity as indicated by reduced expression of canonical Notch targets. Urothelial integrity is reconstituted upon exogenous re-activation of the Notch pathway implying a direct involvement of Notch. Despite damage and inflammation, urothelial cells fail to proliferate, uncovering a possible role for integrin α4 in urothelial homeostasis. Overall, our data support a broad role for Notch in bladder homeostasis involving urothelial cell crosstalk with the microenvironment. Genetic and epigenetic alterations are key features of urothelial cancer. Histone modifying enzymes are affected in the majority of the cases of human bladder cancers, with alterations in both lysine demethylases (KDM6A/UTX) and methyltransferases (KMT2C/MLL3). A recent report suggests that Mll3 abrogation leads to ureter cancer in mice, a phenotype reminiscent of what observed upon inactivation of Notch signaling in mouse models as well. Lineage tracing experiments described in this thesis showed that Kdm6a ablation accelerates the development of squamous cell carcinoma in the mouse bladder, under chemical induced carcinogenesis conditions. In support of this, it drives the formation of tumors with a higher proliferation rate in mouse xenograft experiments. Deletion of Kmt2c in urothelial cells leads to the development of hyperplasia in vivo, under normal tissue homeostasis conditions. Finally, in vitro clonogenic assays indicated a significantly higher clonogenic potential for primary urothelial cells lacking above genes, confirming the tumor suppressor role of these epigenetic agents in the mouse urothelium.

Το ουροθήλιο συνιστά ένα µεταβατικό επιθήλιο που καλύπτει την ουρογεννητική οδό και λειτουργεί ως αποτελεσµατικός φραγµός που παρεµποδίζει τη διαφυγή ιόντων, διαλυτών, νερού και τοξικών ουσιών από τα ούρα στην κυκλοφορία του αίµατος. Αποτελείται από τρείς κυτταρικούς τύπους, τα κύτταρα της βασικής, ενδιάµεσης και επιφανειακής στιβάδας. Πρόκειται για ένα εφησυχασµένο ιστό, ο οποίος αναγεννάται άµεσα µετά από οξείες βλάβες, αλλά η διαδικασία της αναγέννησης δεν έχει αποσαφηνιστεί. Παρόλο που µερικές µελέτες υποδηλώνουν την παρουσία προγονικών κυττάρων στον ιστό, η ταυτότητα και η ακριβής τους τοπολογία, καθώς και ο ρόλος τους κατά την ιστική αναγέννηση ή την καρκινογένεση δεν έχει διαλευκανθεί. Τα αποτελέσµατα της παρούσας διατριβής υποστηρίζουν ότι ένας κυτταρικός υποπληθυσµός της βασικής στιβάδας που χαρακτηρίζεται από την έκφραση της κερατίνης 14 συνιστά των πληθυσµό των βλαστικών κυττάρων του ιστού, καθώς έχει δυνατότητα αυτοανανέωσης και παραγωγής όλων των κυτταρικών τύπων του ουροθηλίου, συµπεριλαµβανοµένων των πλέον διαφοροποιηµένων κυττάρων της επιφανειακής στιβάδας, τόσο στα πλαίσια φυσιολογικής, όσο και επαγώµενης µέσω χηµικού τραυµατισµού αναγγενητικής διαδικασίας. Επιπλέον, τα ίδια κύτταρα αντιπροσωπεύουν τα κύτταρα προέλευσης του καρκίνου του ουροθηλίου, όπως υποδεικνύεται από την εφαρµογή ενός επαγώµενου µοντέλου χηµικής καρκινογένεσης in vivo. Πρόσφατα δηµοσιευµένα δεδοµένα του εργαστηρίου µας αναφέρουν ότι το σηµατοδοτικό µονοπάτι Notch που µεσολαβεί στη διακυτταρική επικοινωνία ρυθµίζοντας σηµαντικές κυτταρικές διαδικασίες και αποφάσεις κυτταρικής τύχης σε πολλούς ιστούς, έχει ογκοκατασταλτικό ρόλο στην ουροδόχο κύστη του ποντικού, ενώ µεταλλάξεις σε συστατικά του µονοπατιού έχουν επίσης ταυτοποιηθεί στον καρκίνο της κύστης στον άνθρωπο. Ωστόσο, τα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης προτείνουν ένα γενικότερο ρόλο για το µονοπάτι Notch στον έλεγχο της ακεραιότητας του επιθηλίου και της λειτουργίας της κύστης του ποντικού. Η αδρανοποίηση του µονοπατιού σε µοντέλα ποντικών συνεπάγεται υποέκφραση συστατικών που διαµεσολαβούν στη διακυτταρική επικοινωνία και στην αλληλεπίδραση κυττάρου και εξωκυττάριου χώρου, συµπεριλαµβανοµένων πρωτεϊνών που έχουν εµπλακεί στη διάµεση κυστίτιδα (γνωστή και ως σύνδροµο επώδυνης κύστης), δοµικές ανωµαλίες και αποκόλληση του βλεννογόνου της κύστης, φλεγµονή και διαταραχή του ουροθηλιακού φραγµού. Το µοριακό προφίλ ουροδόχων κύστεων ποντικών µε τον παραπάνω φαινότυπο, έδειξε οµοιότητες µε τους ιστούς ασθενών διάµεσης κυστίτιδας, οι οποίοι επίσης χαρακτηρίζονται από µειωµένη έκφραση γονιδίων στόχων του σηµατοδοτικού µονοπατιού Notch. Η ακεραιότητα του ουροθηλίου αποκαθίσταται κατά την εξωγενή επανενεργοποίηση του µονοπατιού υποδηλώνοντας άµεση συµµετοχή της σηµατοδότησης µέσω Notch. Παρά την ιστική βλάβη και φλεγµονή, δεν ανιχνεύεται κυτταρικός πολλαπλασιασµός στο ουροθήλιο, γεγονός που υποδηλώνει έναν πιθανό ρόλο για την ιντεγκρίνη α4 στην οµοιόσταση του ιστού. Συνολικά, τα δεδοµένα µας υποδηλώνουν έναν ευρύτερο ρόλο για το συγκεκριµένο µονοπάτι στην οµοιόσταση του ιστού, συµπεριλαµβανοµένης της αλληλεπίδρασης των ουροθηλιακών κυττάρων µε το µικροπεριβάλλον. Ο ουροθηλιακός καρκίνος εκτός από γενετικές, έχει συσχετιστεί και µε επιγενετικές µεταβολές, καθώς η πλειοψηφία των ανθρώπινων καρκίνων της ουροδόχου κύστης, χαρακτηρίζεται από µεταλλαγές σε επιγενετικούς παράγοντες, στους οποίους συπεριλαµβάνονται ένζυµα που τροποποιούν τις ιστόνες, όπως αποµεθυλάσες λυσίνης (KDM6A/UTX) και µεθυλοτρανσφεράσες (KMT2C/MLL3). Μάλιστα, πρόσφατη µελέτη υποστηρίζει ότι η αδρανοποίηση του Mll3 γονιδίου οδηγεί στην ανάπτυξη καρκίνου στον ουρητήρα σε µοντέλα ποντικών, έναν φαινότυπο αντίστοιχο µε αυτόν που παρατηρείται κατά την αδρανοποίηση του µονοπατιού Notch in vivo. Στα πλαίσια πειραµάτων γενεαλογικού εντοπισµού διαπιστώσαµε ότι η απαλοιφή του Kdm6a γονιδίου επιταχύνει την ανάπτυξη κατεξοχήν πλακώδους καρκινώµατος στην ουροδόχο κύστη του ποντικού, υπό συνθήκες χηµικής καρκινογένεσης. Υποστηρικτικά σε αυτό, στα πλαίσια πειραµάτων αλλοµεταµόσχευσης οδηγεί στην ανάπτυξη όγκων µε υψηλότερο δυναµικό πολλαπλασιασµού. Η εξάλειψη του Kmt2c γονιδίου στο ουροθήλιο, συνεπάγεται την ανάπτυξη υπερπλασίας υπό συνθήκες οµοιόστασης in vivo. Τέλος, in vitro δοκιµασίες υποδεικνύουν σηµαντικά υψηλότερο κλωνογενετικό δυναµικό για τα πρωτογενή ουροθηλιακά κύτταρα στα οποία τα παραπάνω γονίδια κατά συνθήκη απαλείφονται, επιβεβαιώνοντας τον ογκοκασταλτικό ρόλο των συγκεκριµένων επιγενετικών παραγόντων στο ουροθήλιο του ποντικού.