An integrated metabolomics approach using HR-LC-MS, NMR and chemometrics for the profiling of the red alga Laurencia: dereplication, tracing of bioactive compounds and detection of new natural products

Abstract

Natural products, originating from terrestrial or marine organisms, constitute a prolific source for pharmaceutically relevant products providing unique structural chemodiversity. The marine environment, covering approximately 70% of the Earth’s surface hosts a largely unexplored biodiversity, offering a huge potential for the discovery of novel compounds to target incurable diseases or overcome drug resistance. Due to the wide range of competitive ecosystems they survive in, marine organisms have developed unique defense strategies and bioactive compounds that, in some cases, are unparalleled by their terrestrial counterparts.Red algae of the genus Laurencia are considered as one of the richest sources of new secondary metabolites. The genus Laurencia currently encompasses 146 taxonomically accepted species which are mainly found in tropical, subtropical, and temperate coastal waters, including the Mediterranean Sea. Although intensively investigated for the last 50 years, new metabolites are still being isolated from Laurencia species. Displaying more than 1,200 records in MarinLit database, Laurencia species biosynthesize a wide spectrum of secondary metabolites, including sesquiterpenes, diterpenes, triterpenes and C15 acetogenins that are frequently characterized by the presence of halogen atoms. An array of the isolated metabolites exhibit important activities, such as antibacterial, antifungal, insecticidal and cytotoxic, as reviewed in Chapter 1.Recent reports comment on the complexity of the taxonomy of red algae of the genus Laurencia which is related to the extended morphological plasticity along with the chemical variation influenced to a significant degree by environmental and genetic factors. Past attempts towards species identification based on characteristic metabolites have proven unsuccessful and more importantly efforts to re-isolate bioactive compounds were severely impeded.Metabolomics consists an emerging technology with applications expanding in different areas, such as health, natural products, biotechnological applications and nutrition. Metabolomics platforms have been only applied to a limited number of projects relating to marine organisms. Metabolomics studies require the application of high-throughput analytical techniques, such as NMR spectroscopy and mass spectrometry (MS), in combination with software (s/w) tools and databases. The high number of compounds with unknown structures and the limited information retrieved from databases generated for marine organisms reflect the increased difficulty in assessing the complex metabolome of the marine ecosystem. Applications of metabolomics in marine organisms and research challenges are reviewed in Chapter 2.The current study addressed the global secondary metabolic profile of Laurencia crude extracts by applying state-of-the-art holistic techniques, i.e. UHPLC–PDA–HRMS and HR NMR spectroscopy, along with software tools, databases (MarinLit and those developed in-house) and multivariate data analysis tools.The developed pipeline described in Chapter 4 was applied as a screening strategy for dereplication purposes and for pinpointing the presence of new metabolites already from the very early stages of a chemical investigation and prioritize selected Laurencia crude extracts to be further subjected to the long and laborious procedure of in-depth phytochemical analysis. This integrated approach has led to:a) The construction of an ‘in-house’ Laurencia-focused NMR database, incorporating experimental and / or literature NMR data of Laurencia and Aplysia metabolites. The database is implemented in the interface of ACD/Labs s/w and facilitates the interpretation of 2D HSQC data based on simulation algorithms enhancing the confident discrimination of the secondary metabolites present in the sample. The database includes approx. 300 records comprising structurally diverse compounds from the classes of C15 acetogenins, sesquiterpenes and diterpenes.b) The development of an 'in-house’ Laurencia-focused LC-MS library comprising metabolites isolated in the past from Laurencia in our laboratoryc) The rapid detection of two new C15 bromoallene acetogenins in a crude extract of Laurencia chondrioides collected from Kefalonia (marilzallene B and chondrioallene). The obtained results have been published in Kokkotou et al. Phytochemistry, 2014, 108, 208–219.Subsequently, in Chapter 5, an exploratory study comprising 103 Laurencia samples collected across the Greek coastlines investigated the potential of LC-MS/PCA and 1H NMR/PCA untargeted profiling to discriminate patterns among the various Laurencia populations. The major findings of this extended study are summarized in the following:a) The emergence of outlier samples probed to the presence of new natural productsb) Two major metabotypes of Greek Laurencia specimens were revealed, metabotype A comprising an array of C15 acetogenins and metabotype B which is mainly sesquiterpenes-oriented.c) Moreover, the study revealed the influence of the marine eco-region (Ionian and Aegean Sea) relatively to the expression of the two metabotypes on Laurencia obtusa specimens.To the best of our knowledge, this is the first untargeted metabolomics study performed on a high number of Laurencia populations.In Chapter 6, a targeted LC-HRMS approach was applied to the collection of Laurencia populations screening for bioactive diterpenes and specifically the diterpene neorogioltriol (NRG) exhibiting strong anti-inflammatory activity which was initially isolated from a Laurencia glandulifera population from Kefalonia, the structural analog neorogioldiol, as well as the congeners neorogioldiol B and prevezols A-E, isolated from a Greek L. obtusa specimen from the coasts of Preveza. These compounds have been proposed to belong to the same biogenetic pathway and thus this LC-HRMS screening targeted to trace any of them or even related analogues. The presence of the target compounds was identified in a population of Laurencia collected from Vatsa bay (south-west coastal region of Kefalonia). Subsequently, collection of individual specimens of the particular Laurencia population allowed for an intra-population study. LC-MS/PCA analysis clearly revealed intra-population variability and discriminated two clusters from the average population, one associated with an array of diterpenes and another one comprising mainly sesquiterpenes. A reverse “V” shaped PCA map and the allocation of the clusters also implied an interplay between the diterpenes and sesquiterpenes abundance, suggesting a cross-talk between the two pathways related to terpenes biosynthesis, namely MEP (methylerythritol) and MVA (mevalonic acid). This cross-talk could account for the favorable biosynthesis of the bioactive diterpenes at the expense of sesquiterpenes.The seasonal variation of Laurencia secondary metabolome was also demonstrated from this study, possibly driven by the changing of environmental conditions or the exposure to pathogens, epiphytes or herbivores with an impact to the production of bioactive diterpenes or sesquiterpenes.

Το θαλάσσιο περιβάλλον, καλύπτοντας περίπου το 70% της επιφάνειας της Γης, φιλοξενεί μια σε μεγάλο βαθμό ανεξερεύνητη βιοποικιλομορφία, προσφέροντας έτσι μια τεράστια προοπτική για την ανακάλυψη νέων βιοδραστικών ενώσεων, με στόχο τη θεραπεία ανίατων ασθενειών ή την αντιμετώπιση της ανθεκτικότητας στα φάρμακα. Προκειμένου να επιβιώσουν σε ένα διαρκώς ανταγωνιστικό οικοσύστημα, οι θαλάσσιοι οργανισμοί έχουν αναπτύξει μοναδικούς αμυντικούς μηχανισμούς, συνθέτοντας βιοδραστικές ενώσεις, οι οποίες σε ορισμένες περιπτώσεις παρουσιάζουν ασύγκριτη πολυπλοκότητα σε σχέση με τις ενώσεις που συντίθενται από τους χερσαίους οργανισμούς.Τα ροδοφύκη του γένους Laurencia θεωρούνται από τις πιο πλούσιες πηγές θαλάσσιας προέλευσης νέων δευτερογενών μεταβολιτών. Το γένος Laurencia περιλαμβάνει έως σήμερα 146 ταξινομικά αποδεκτά είδη, τα οποία συναντώνται κυρίως σε τροπικές, υποτροπικές και εύκρατες παράκτιες περιοχές, συμπεριλαμβανομένης και της Μεσογείου Θάλασσας. Παρόλο που έχει μελετηθεί εκτεταμένα τα τελευταία 50 χρόνια - οι σχετικές καταχωρήσεις στη βάση δεδομένων MarinLit υπερβαίνουν τις 1.200 - νέοι μεταβολίτες εξακολουθούν να απομονώνονται από τα είδη του γένους. Τα είδη του γένους Laurencia βιοσυνθέτουν ένα ευρύ φάσμα δευτερογενών μεταβολιτών, περιλαμβάνοντας σεσκιτερπένια, διτερπένια, τριτερπένια και C15 ακετογενίνες, οι οποίοι συχνά χαρακτηρίζονται από την παρουσία αλογόνων. Ένας μεγάλος αριθμός απομονωμένων μεταβολιτών εμφανίζει σημαντική βιολογική δράση, όπως αντιβακτηριακή, αντιμυκητιακή, εντομοκτόνο και κυτταροτοξική, όπως παρουσιάζεται από την ανασκόπηση της βιβλιογραφίας στο Κεφάλαιο 1. Πρόσφατες αναφορές εστιάζουν στην πολυπλοκότητα της ταξινόμησης των ροδοφυκών του γένους Laurencia, η οποία σχετίζεται με την εκτεταμένη μορφολογική πλαστικότητα, σε συνδυασμό με τη χημική διακύμανση, αντανακλώντας σε σημαντικό βαθμό την επίδραση περιβαλλοντικών και γενετικών παραγόντων. Η μεταβολομική αποτελεί μια αναδυόμενη τεχνολογία με εφαρμογές που εκτείνονται σε διάφορους τομείς, όπως η υγεία, τα φυσικά προϊόντα, οι βιοτεχνολογικές εφαρμογές και η διατροφή, ενώ ο αριθμός των μεταβολομικών μελετών σε θαλάσσιους οργανισμούς είναι περιορισμένος. Για μια μεταβολομική μελέτη απαιτείται η εφαρμογή αναλυτικών τεχνικών υψηλής απόδοσης, όπως η φασματοσκοπία NMR και η φασματομετρία μάζας (MS), σε συνδυασμό με εξειδικευμένα λογισμικά και βάσεις δεδομένων. Όσον αφορά στους θαλάσσιους οργανισμούς, ο μεγάλος αριθμός ενώσεων με άγνωστες δομές, καθώς και ο περιορισμένος αριθμός δεδομένων που μπορεί να ανακτηθεί από βάσεις δεδομένων, εξειδικευμένων στα φυσικά προϊόντα θαλάσσιας προέλευσης, αντανακλούν την αυξημένη δυσκολία στην αποτίμηση του πολύπλοκου μεταβολικού αποτυπώματος τους. Εφαρμογές της μεταβολομικής στους θαλάσσιους οργανισμούς και οι ερευνητικές προκλήσεις που σχετίζονται με αυτές εξετάζονται στο Κεφάλαιο 2. Η παρούσα μελέτη στόχευσε στο συνολικό δευτερογενές μεταβολικό αποτύπωμα εκχυλισμάτων της Laurencia εφαρμόζοντας σύγχρονες ολιστικές τεχνικές, όπως φασματοσκοπία UHPLC-PDA-HRMS και ΗR NMR, και εξειδικευμένα λογισμικά επεξεργασίας των πειραματικών δεδομένων, βάσεις δεδομένων εμπορικά διαθέσιμες (MarinLit), καθώς και in-house βιβλιοθήκες δεδομένων που αναπτύχθηκαν και εργαλεία πολυμεταβλητής ανάλυσης. Η μεθοδολογία, η οποία αναπτύχθηκε και περιγράφεται στο Κεφάλαιο 4, εφαρμόστηκε για τη σάρωση εκχυλισμάτων του γένους Laurencia ώστε να αναγνωριστούν ήδη γνωστοί βιβλιογραφικά μεταβολίτες (dereplication) και παράλληλα να εντοπιστεί η παρουσία νέων μεταβολιτών από τα πρώτα στάδια της χημικής ανάλυσης, ιεραρχώντας με αυτό τον τρόπο ποια δείγματα θα υποβάλλονταν περαιτέρω στη μακρά και επίπονη διαδικασία της φυτοχημικής ανάλυσης. Αυτή η ολοκληρωμένη προσέγγιση οδήγησε: α) Στην υλοποίηση μιας ‘in-house’ βάσης δεδομένων NMR που εστιάζει στα ροδοφύκη του γένους Laurencia και περιλαμβάνει πειραματικά ή/και βιβλιογραφικά δεδομένα NMR για δευτερογενείς μεταβολίτες προερχόμενους από είδη Laurencia και Aplysia, γνωστού και ως «λαγού της θάλασσας» που παρουσιάζει στενή οικολογική σχέση με τη Laurencia καθώς αυτή αποτελεί μέρος της διατροφής του. Η βάση δεδομένων υλοποιήθηκε στο περιβάλλον του λογισμικού ACD/Labs και διευκολύνει την αποτίμηση των δεδομένων 2D HSQC NMR με τη χρήση αλγορίθμων προσομοίωσης, οδηγώντας στην ασφαλή ταυτοποίηση των δευτερογενών μεταβολιτών που υπάρχουν στο δείγμα. Η βάση δεδομένων περιλαμβάνει περίπου 300 εγγραφές που αντιστοιχούν σε δομικά διαφορετικές ενώσεις από τις κατηγορίες των C15 ακετογενινών, σεσκιτερπενίων και διτερπενίων. β) Στην ανάπτυξη μιας βιβλιοθήκης LC-MS που περιλαμβάνει μεταβολίτες της Laurencia που έχουν απομονωθεί στο παρελθόν στο εργαστήριό μας γ) Στον ταχύτατο εντοπισμό δύο νέων C15 ακετογενινών της ομάδας των βρωμοαλλενίων (μαριλζαλλένιο B και χονδριοαλλένιο) σε ένα εκχύλισμα του είδους Laurencia chondrioides που συλλέχθηκε στην Κεφαλονιά. Τα αποτελέσματα της μελέτης έχουν ήδη δημοσιευθεί (Kokkotou et al., Phytochemistry, 2014, 108, 208-219). Στη συνέχεια, στο Κεφάλαιο 5, εκπονήθηκε μια μελέτη που περιλάμβανε 103 δείγματα από είδη Laurencia από τις Ελληνικές ακτές, η οποία διερεύνησε τη δυνατότητα της ανάλυσης του ολικού δευτερογενούς μεταβολικού αποτυπώματος με την εφαρμογή LC-MS/PCA και 1H NMR/PCA με στόχο τη διάκριση μοτίβων μεταξύ των διαφόρων πληθυσμών του φύκους. Τα κύρια ευρήματα αυτής της μελέτης συνοψίζονται στα ακόλουθα: α) Δείγματα Laurencia, τα οποία αναδείχθηκαν ως έκτροπα (outliers) υπέδειξαν την παρουσία νέων φυσικών προϊόντων β) Aναδείχθηκαν δύο κύριοι μεταβολικοί τύποι (metabotypes) στα δείγματα Laurencia που μελετήθηκαν, ο μεταβολικός τύπος Α που περιλαμβάνει ένα φάσμα C15 ακετογενινών και ο μεταβολικός τύπος Β, που χαρακτηρίζεται κυρίως από την παρουσία σεσκιτερπενίων. γ) Επιπλέον, η μελέτη αποκάλυψε την επίδραση τη θαλάσσιας οικολογικής περιοχής (Ιόνιο και Αιγαίο Πέλαγος) σε σχέση με την έκφραση των δύο μεταβολικών τύπων στα δείγματα του είδους Laurencia obtusa. Αυτή είναι η πρώτη μεταβολομική μελέτη του ολικού δευτερογενούς μεταβολικού αποτυπώματος, η οποία πραγματοποιείται σε μεγάλο αριθμό πληθυσμών του γένους Laurencia. Στο Κεφάλαιο 6 εφαρμόστηκε στοχευμένη LC-HRMS σάρωση σε συλλογή πληθυσμών του γένους Laurencia για τον εντοπισμό βιοδραστικών διτερπενίων και συγκεκριμένα του διτερπενίου νεοροτζιολτριόλη (NRG) με ισχυρή αντιφλεγμονώδη δράση, το οποίο είχε απομονωθεί αρχικά από έναν πληθυσμό Laurencia glandulifera από την Κεφαλονιά, ενός δομικού αναλόγου της, της νεοροτζιολδιόλης, καθώς και των συγγενών δομών νεοροτζιολδιόλη Β και πρεβεζόλες Α-Ε, που είχαν απομονωθεί από ένα δείγμα L. obtusa από τις ακτές της Πρέβεζας. Αυτές οι ενώσεις πιθανόν να ανήκουν στo ίδιo βιοσυνθετικό μονοπάτι και έτσι αυτή η μελέτη σάρωσης με LC-HRMS στόχευσε στην ανίχνευση αυτών των διτερπενίων ή ακόμη και συναφών αναλόγων. Η παρουσία των ενώσεων-στόχων εντοπίστηκε σε πληθυσμό Laurencia sp. που συλλέχθηκε από τον κόλπο της Βάτσας στη Κεφαλονιά. Στη συνέχεια, η συλλογή από την ίδια περιοχή μεμονωμένων στελεχών του συγκεκριμένου πληθυσμού επέτρεψε τη διεξαγωγή μιας ενδο-πληθυσμιακής μελέτης. Η ανάλυση LC-HRMS/PCA κατέδειξε σαφώς την ενδο-πληθυσμιακή διακύμανση στο περιεχόμενο, αλλά ακόμα και την παρουσία/απουσία των ενώσεων-στόχων και περαιτέρω ξεχώρισε δύο ομάδες δειγμάτων συγκριτικά με τον μέσο πληθυσμό, μία ομάδα που χαρακτηρίζεται από ένα φάσμα διτερπενίων και μία άλλη ομάδα που περιλαμβάνει κυρίως σεσκιτερπένια. Στο χάρτη της PCA, η κατανομή των δειγμάτων σε σχήμα αντεστραμμένου "V", καθώς και η διευθέτηση των προαναφερθέντων ομάδων δειγμάτων υποδηλώνουν μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της αφθονίας των διτερπενίων και των σεσκιτερπενίων, αναδεικνύοντας έτσι μία «αλληλεπίδραση» (cross-talk) μεταξύ των δύο οδών που σχετίζονται με τη βιοσύνθεση των τερπενίων, δηλαδή το μονοπάτι της μεθυλερυθριτόλης (MEP) και το μονοπάτι του μεβαλονικού οξέος (MVA). Αυτή η διασύνδεση ίσως αποτελεί μια ερμηνεία για την προτιμώμενη βιοσύνθεση των βιοδραστικών διτερπενίων εις βάρος των σεσκιτερπενίων.Η μελέτη ανέδειξε επίσης την εποχιακή διακύμανση του δευτερογενούς μεταβολικού προφίλ του συγκεκριμένου πληθυσμού του ροδοφύκους, η οποία πιθανώς να εξαρτάται από τη μεταβολή των περιβαλλοντικών συνθηκών ή από την έκθεση σε παθογόνους παράγοντες, επιφυτικούς ή φυτοφάγους οργανισμούς με συνέπεια την παραγωγή βιοδραστικών διτερπενίων ή σεσκιτερπενίων.