Απομόνωση γενετικού υλικού και μεθυλιωτική τροποποίηση στα άρρενα γαμετικά κύτταρα

Abstract

We intend to investigate the overall methylation level and the four different patterns on methylation status of two CpGs (mCmC, mCuC, uCmC, uCuC) of LINE-1 on normozoospermic and oligospermic men.DNA methylation in mammals is a dynamic and strictly controlled process which is involved in numerous cellular processes, cell differentiation, regulation of gene expression, genome reprogramming and silencing of repetitive elements.In mammals, the epigenetic reprogramming is crucial for germ cells development. The principal epigenetic regulatory mechanism is DNA methylation and occurs in the phase of gametogenesis and upon early embryo stages. During gametogenesis there are occurred periods of DNA methylation and demethylation. There are 500.00 copies of LINE-1 in the human genome. Aberrant DNA methylation levels of LINE-1 have been implicated in various human diseases.The study consisted of 92 men. A detailed medical history was obtained from all subjects. The subjects were split into two groups: normozoospermic (70 men) and oligospermic (22 men, <20x106 spermatozoa). The oligospermic group was classified into Mid (1 man, 10-20x106 spermatozoa), Moderate (12 men, 5-10x106 spermatozoa) and Severe (9 men <5x106 spermatozoa). Semen was analyzed according to the WHO criteria. LINE-1 overall methylation level and methylation pattern of the oligospermic group were compared to the normozoospermic one. Methylation level and pattern of LINE-1 was measured via COBRA. DNA was extracted from human sperm and treated with sodium Bisulfite. DNA was amplified using primers which were designed to amplify 5΄UTR. Amplicons were digested with enzymes. Products were electrophoresed in polyacrylamide-gel and the intensities of the bands were measured by a phosphoimager. COBRA assays were performed in duplicate. For intra-inter assay variation DNA from Hela, Jurkat and Daudi cells as positive controls were used. A major limitation in Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA) is that high proportion of DNA is too degradated to be analyzed. COBRALINE-1 results were sorted into four groups according on the methylation the status of the two CpG dinucleotides from the 5΄-3΄ends of sequence: hypermethylation (mCmC), hypomethylation (uCuC), partial methylation of the 5΄(mCuC) and partial methylation of the 3΄(uCmC). From statistical analysis revealed significant differences (p=0.039) in the overall methylation levels of LINE-1 in the normozoospemic and severe oligospermia samples. We observed that in the severe oligospermia samples the overall methylation levels (41.52%) were significant higher levels than in normozoospemic samples (40.62%).From the correlation analysis in normozoospemic samples found statistically significant relationship (p=0.031) between the levels of the partially methylated pattern mCuC and hypomethylated uCuC motif. It was found that there is a direct correlation (r=0.258) between the two patterns. In oligospermic there was no significant difference.

Το γένωμα των ευκαρυωτικών οργανισμών, εκτός από τα γονίδια, αποτελείται και από επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA οι οποίες καταλαμβάνουν το 50% του ανθρώπινου γενώματος. Τα μεταθετά στοιχεία ή τρανσποζόνια είναι μη κωδικές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA, οι οποίες έχουν την ιδιότητα να μεταπηδούν σε νέες θέσεις στο γένωμα, μια ιδιότητά τους γνωστή ως μετάθεση. Τα μεταθετά στοιχεία κατηγοριοποιούνται σε δυο κύριες τάξεις, στα DNA τρανσποζόνια και στα ρετροτρανσποζόνια. Τα ρετροτρανσποζόνια είναι ενδογενή στοιχεία των ευκαρυωτικών οργανισμών. Αποτελούν το 90% του συνόλου των μεταθετών στοιχείων στον άνθρωπο. Τα μακρά διάσπαρτα πυρηνικά στοιχεία, LINEs, είναι τα πιο μελετημένα αυτόνομα ρετροτρανσποζόνια χωρίς LTR. Καταλαμβάνουν το 20% του γενώματος στον άνθρωπο με περίπου 700.000 αντίγραφα. Τα LINE-1 παρά το μεγάλο αριθμό αντιγράφων στο ανθρώπινο γονιδίωμα, τα πλήρους μήκους είναι περίπου 3.000 με 5.000 ενώ τα ενεργά είναι περίπου 100. Άλλη μια σημαντική κατηγορία ρετρομεθετών είναι οι ενδογενείς ρετροϊοί HERV-K10. Οι ανθρώπινοι ενδογενείς ρετροϊοί (Human endogenous retrovirus, HERV) αποτελούν τα κατάλοιπα της μόλυνσης των ανθρώπινων γαμετικών κυττάρων από εξωγενείς ρετροϊούς. Σε έναν πολυκύτταρο οργανισμό είναι σαφές πως για την ανάπτυξή του απαραίτητες είναι και οι επιγενετικές τροποποιήσεις ορίζουν το πότε και που θα εκφραστούν τα γονίδια. Η μόνη μελετημένη επιγενετική τροποποίηση του DNA είναι η μεθυλίωση. Η μεθυλίωση του DNA στα θηλαστικά αποτελεί μια δυναμική αλλά και αυστηρά ελεγχόμενη διαδικασία, η οποία συμμετέχει σε πληθώρα κυτταρικών διεργασιών και αποτελεί ταυτόχρονα και το σημαντικότερο επιγενετικό παράγοντα στη μεταγραφική αποσιώπηση των γονιδίων (gene silencing). Η μεθυλίωση του DNA μπορεί να καταστείλει τη μεταγραφή των γονιδίων είτε άμεσα είτε έμμεσα τόσο σε επίπεδο χρωματίνης όσο και σε επίπεδο γονιδίου.Τα μεταθετά στοιχεία των γαμετών υπόκεινται σε επαναπρογραμματισμό της DNA μεθυλίωσης τους, που συμβαίνει σε δυο στάδια. Στο πρώτο στάδιο έχουμε την απομεθυλίωση των μεταθετών στοιχείων των αρρένων γαμετικών κυττάρων και λαμβάνει χώρα κατά τη μετακίνηση των PGCs στις αρχέγονες γονάδες. Τα μεταθετά στοιχεία LINES, IAP αλλά και περιοχές μικροδορυφορικού DNA απομεθυλιώνονται σταδιακά και όχι πλήρως διατηρώντας το 16-60% της αρχικής μεθυλίωσης του DNA. Την απομεθυλίωση ακολουθεί ηde novo μεθυλίωση του DNA μεταθετών στοιχείων και συμβαίνει στα μη διαιρούμενα ΕGCs στο στάδιο πριν εισέλθουν στη μείωση.Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η μελέτη και η ποσοτικοποίηση του συνόλου της μεθυλίωσης και των μοτίβων μεθυλίωσης με βάση τη μεθυλιωτική κατάσταση των CpGs των ρετρομεταθετών στοιχείων LINE-1 ανάμεσα σε σπερματοζωάρια από δείγματα σπέρματος με φυσιολογικές παραμέτρους και σε σπερματοζωάρια από δείγματα σπέρματοςμε μη φυσιολογικές παραμέτρους. Επίσης σκοπός της διατριβής είναι η μελέτη της έκφρασης των ρετρομεταθετών στοιχείων LINE-1 και HERV-K10 στα σπερματοζωάρια.Αρχικά μελετήσαμε το συνολικό ποσοστό μεθυλίωσης (mC) των LINE-1 όσο και το ποσοστό εμφάνισης των τεσσάρων μοτίβων μεθυλίωσης των CpGs (mCuC, uCmC, mCmC, uCuC) μεταξύ της ομάδας των ολιγοσπερμικών και φυσιολογικών δειγμάτων ως προς τις παραμέτρους του σπέρματος. Τα αποτελέσματά μας δεν έδειξαν στατιστικά σημαντική διαφορά. Συνεπώς, ο ολιγοσπερμικός φαινότυπος δε συνδέεται με διαταραχές της μεθυλίωσης και των μοτίβων του LINE-1 ρετρομεταθετού. Εν συνεχεία μελετήσαμε το συνολικό ποσοστό μεθυλίωσης των LINE-1 όσο και το ποσοστό εμφάνισης των τεσσάρων μοτίβων μεθυλίωσης των CpGs μεταξύ της ομάδας των σοβαρά ολιγοσπερμικών και φυσιολογικών δειγμάτων ως προς τις παραμέτρους του σπέρματος. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως υπάρχει στατιστικώς σημαντική διαφορά στο σύνολο της μεθυλίωσης μεταξύ φυσιολογικών και σοβαρά ολιγοσπερμικών δειγμάτων, ενώ δε βρέθηκε σημαντική διαφορά στη συχνότητα εμφάνισης των μοτίβων.Επόμενο στάδιο ήταν η συσχέτιση των μοτίβων μεθυλίωσης. Από τα αποτελέσματά μας, φαίνεται φάνηκε ότι στο σύνολο των ολιγοσπερμικών δειγμάτων, το μερικώς μεθυλιωμένο μοτίβο mCuC συσχετίζεται αρνητικά με το πλήρως μεθυλιωμένο μοτίβο mCmC, κάτι που δε συμβαίνει στα φυσιολογικά. Δηλαδή, η μείωση εμφάνισης του μοτίβου mCmC σχετίζεται με την αύξηση στη συχνότητα εμφάνισης του μοτίβου mCuC.Στη μελέτη μας βρέθηκαν φυσιολογικά δείγματα με μονο μεθυλιωμένα αντίγραφα ΗERV-K10 αλλά και φυσιολογικά δείγματα με μεθυλιωμένα και απομεθυλιωμένα HERV-K10 ενώ όλα τα ολιγοσπερμικά δείγματα με μη φυσιολογικές παραμέτρους, είχαν μεθυλιωμένα και μη μεθυλιωμένα αντίγραφα. Παρατηρούμε πως ανάμεσα στα ολιγοσπερμικά και στα φυσιολογικά δείγματα υπάρχει διαταραχή της μεθυλίωσης των HERV-K10.H έκφραση των ρετρομεταθετών είναι συνήθως υπό κυτταρικό έλεγχο, εξασφαλίζοντας την κανονική λειτουργία των κυττάρων αποτρέποντας την υπερέκφραση τους. Η συνολική μεθυλίωση του DNA, η οποία αποτελεί τον κύριο ρυθμιστή της έκφρασης των ρετροτρανσποζονίων, αναμένεται σε υψηλό ποσοστό στα ώριμα σπερματοζωάρια θηλαστικών και ανθρώπων. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι τα ρετρομεταθετά LINE-1, HERV-K10 και SVA εκφράζονται στα σπερματοζωάρια ολιγοσπερμικών και φυσιολογικών αντρών. Η έκφρασή τους πιθανώς να αποδίδεται στην υπομεθυλίωση συγκεκριμένων περιοχών των σπερματοζωαρίων ή σε πρόσκαιρη υπομεθυλίωση του γονιδιώματος ορισμένων σπερματοζωαρίων ή μπορεί να είναι διατηρημένα μόρια RNA που έχουν εκφραστεί στα αρχικά στάδια της γαμετογένεσης