Μελέτη του μηχανισμού αναγνώρισης του υποστρώματος από τα θυσανόποδα

Abstract

Reproduction in barnacles relies on chemical cues that guide their gregarious settlement. These cues have been pinned down to several sources of settlement pheromones, one of which is a protein termed Settlement-Inducing Protein Complex (SIPC), a large glycoprotein acting as a pheromone to induce larval settlement and as an adhesive in the surface exploration by the cyprids. Settlement assays with Amphibalanus (=Balanus) amphitrite cyprids in the presence of SIPC showed that cyprids exhibit settlement preference behaviour at lower concentrations (EC50=3.73 nM) and settlement avoidance behaviour at higher concentrations of SIPC (IC50=101 nM). By using truncated fragments of SIPC in settlement assays, we identified that domains at the N-terminal of SIPC transduce settlement preference cues that mask the settlement avoidance cues transduced by domains at its C-terminal. Removing the N-terminal 600 amino acids from SIPC resulted in truncated fragments that transduced only settlement avoidance cues to the cyprids. From the sexual reproduction point of view, this bimodal response of barnacles to SIPC explains that barnacles will settle gregariously when conspecific cues are sparse but will not settle if conspecific cues inform of overcrowding that will increase reproductive competition and diminish their reproductive chances.To achieve their reproductive potential, barnacles combine tactile exploration of surface structural properties and integration of cellular signals originating from their antennular sensory setae within a developmentally defined, temporally narrow window of settlement opportunity. Behavioural assays with cyprids coupled with biometric analysis of scanning electron microscopy-acquired images in the presence of specific chemical compounds were used to investigate how settlement on a substratum is altered in response to the presence of these compounds. It is shown that impeding tactile exploration, altering cellular signalling and/or inducing malformations of anatomical features of the antennular sensory setae can disrupt the settlement behaviour of the model barnacle species A. amphitrite. It is concluded that surface exploration by the cyprids relies on mechanical and nociception-related and calcium-mediated signals while a protein kinase C signalling cascade controls the timely metamorphosis of the cyprids to sessile juveniles.Combining the experimental results, it is proposed that SIPC probably activates increases in intracellular calcium in the sensory neurons of the antennular sensory setae of the cyprids during their surface exploration phase. These calcium increases are propagated via nociceptive, calcium-regulated channels and stimulate the settlement process. A similar mechanism has been recently discovered to mediate the signaling mechanism of α2-macroglobulin, the immune system protein that is phylogenetically related to SIPC.

Το θέμα της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι η μελέτη των σχέσεων δομής-λειτουργίας της πρωτεΐνης SIPC και του μηχανισμού μετάδοσης σήματος στον οποίο διαμεσολαβεί η πρωτεΐνη αυτή κατά την αναγνώριση του υποστρώματος από το Θυσανόποδο, Amphibalanus amphitrite, αλλά και τα σηματοδοτικά μονοπάτια που καθορίζουν τη συμπεριφορά των Θυσανόποδων του είδους αυτού κατά τη διάρκεια εξερεύνησης του υποστρώματος μέχρι και την εγκατάστασή τους.Έρευνες στο συγκεκριμένο είδος έδειξαν ότι τα ζώα αυτά εκκρίνουν και προσκολλούν μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη στο υπόστρωμα, την Settlement-Inducing Protein Complex (SIPC), η οποία βοηθάει άτομα του ίδιου είδους να αναγνωρίσουν το υπόστρωμα αυτό ως ιδανικό για εγκατάσταση με σκοπό την αναπαραγωγή. Στόχος της διδακτορικής διατριβής είναι ο εντοπισμός του σηματοδοτικού μηχανισμού που ενεργοποιεί ο υποδοχέας της πρωτεΐνης SIPC στο είδος A. amphitrite, κάτι που θα ανοίξει το δρόμο για τον εντοπισμό χημικών ενώσεων που θα αποτρέπουν την ενεργοποίηση αυτού του μηχανισμού και, κατ’ επέκταση την εγκατάσταση των κυπρίδων σε θαλάσσια υποστρώματα.Πρώτο σκέλος πειραμάτων: Τα Θυσανόποδα για να επιτύχουν την αναπαραγωγή τους βασίζονται σε χημικά σήματα που τα οδηγούν στο σχηματισμό αποικιών. Ένα τέτοιο χημικό σήμα είναι η πρωτεΐνη SIPC, μια μεγάλη γλυκοπρωτεΐνη που λειτουργεί ως φερορμόνη και προάγει την εγκατάσταση των κυπρίδων. Σε αυτό το σκέλος πειραμάτων, αποδεικνύουμε ότι η ανασυνδυασμένη SIPC είναι μία γλυκοπρωτεΐνη με μοριακό βάρος (MΒ) σημαντικά μεγαλύτερο από το θεωρητικό της, που μεταδίδει σήματα πρόκλησης ή αποφυγής της εγκατάστασης. Η μελέτη του μηχανισμού αναγνώρισης του υποστρώματος από τις κυπρίδες του είδους A.amphitrite σε συνθήκες παρουσίας της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης SIPC έδειξε ότι οι χαμηλές συγκεντρώσεις της SIPC (EC50=3.73 nM) προάγουν την εγκατάσταση και τη μεταμόρφωση των κυπρίδων σε εδραίους οργανισμούς και οι υψηλές συγκεντρώσεις της SIPC (IC50=101 nM) δρουν ανασταλτικά ως προς την εγκατάσταση τους. Οι βιοδοκιμές που πραγματοποιήθηκαν παρουσία των μικρότερων χιμαιρικών μορίων έδειξαν πως τα μόρια που περιείχαν τα 600 αμινοξέα στο αμινοτελικό άκρο της SIPC προήγαγαν την εγκατάσταση ενώ στα μόρια που είχαν αφαιρεθεί τα αμινοξέα αυτά προκάλεσαν αποφυγή εγκατάστασης. Στην περιοχή των 600 αμινοξέων εντοπίστηκαν γλυκοζυλιώσεις καθώς επίσης και η κολλώδης φυσικοχημική ιδιότητα της πρωτεΐνης αυτής. Η απόκριση των Θυσανόποδων στο διττό ρόλο (πρόκληση και αποφυγή της εγκατάστασης) της ανασυνδυασμένης SIPC, δείχνει ότι η συμπεριφορά εγκατάστασης και επομένως η αναπαραγωγική επιτυχία των εδραίων αυτών οργανισμών, ορίζεται από κάποιο σήμα μεταξύ των ατόμων του ίδιου είδους. Αν το σήμα που λάβει μια κυπρίδα κατά τη διάρκεια αναζήτησης του κατάλληλου υποστρώματος είναι έντονο (υψηλή συγκέντρωση SIPC), τότε θα προτιμήσει κάποιο άλλο υπόστρωμα προς εγκατάσταση, προς αποφυγή του ανταγωνισμού για τους διαθέσιμους πόρους. Αν όμως το σήμα που λάβει είναι ασθενές (χαμηλή συγκέντρωση SIPC), τότε θα προτιμήσει να εγκατασταθεί μόνιμα για να αναπαραχθεί, να αναπτυχθεί και να προστατευθεί από τους θηρευτέςΔεύτερο σκέλος πειραμάτων: Τα Θυσανόποδα κατά τη διάρκεια αναζήτησης του κατάλληλου υποστρώματος προς εγκατάσταση, εξερευνούν το υπόστρωμα μέσω της ‘αφής’ και παράλληλα δέχονται σήματα μέσω των αισθητήριων κεραιών τους μέσα σε ένα σύντομο χρονικό πλαίσιο. Στο πειραματικό αυτό σκέλος έγινε μελέτη των σηματοδοτικών κυτταρικών μονοπατιών που καθορίζουν τη συμπεριφορά των Θυσανόποδων του είδους A. amphitrite κατά τη διάρκεια εξερεύνησης του υποστρώματος μέχρι και την εγκατάστασή τους. Πραγματοποιήθηκαν βιοδοκιμές μελέτης της συμπεριφοράς εγκατάστασης παρουσία ειδικών χημικών ενώσεων σε συνδυασμό με βιομετρική ανάλυση εικόνων που ελήφθησαν σε μικροσκόπιο ηλεκτρονικής σάρωσης (SEM). Διαπιστώθηκε πως η παρεμπόδιση του σταδίου εξερεύνησης μέσω της ‘αφής’, η αλλαγή της κυτταρικής σηματοδότησης και η πρόκληση μορφολογικών δυσμορφιών στις αισθητήριες κεραίες, μπορούν να διαταράξουν τη συμπεριφορά εγκατάστασης του Α. amphitrite. Συμπεραίνεται ότι η εξερεύνηση ενός υποστρώματος βασίζεται σε μηχανο-ευαίσθητα και αλγο-αισθητήρια ασβεστιο-εξαρτώμενα κανάλια, ενώ ο χρόνος μεταμόρφωσης επηρεάζεται από την ενεργότητα μιας ή περισσότερων ισομορφών της πρωτεΐνης κινάσης C.Συνθέτοντας τα δύο σκέλη των πειραματικών προσεγγίσεων προτείνεται ότι η πρωτεΐνη SIPC ενεργοποιεί ταλαντώσεις των ενδοκυττάριων επιπέδων ασβεστίου μέσω αλγο-αισθητήριων, ασβεστιο-εξαρτώμενων καναλιών στους απτικούς νευρώνες των αισθητήριων κεραιών των Θυσανόποδων, εκκινώντας έτσι τη διαδικασία εγκατάστασης των κυπρίδων στο υπόστρωμα. Ένας παρόμοιος μηχανισμός έχει πρόσφατα ανακαλυφθεί ότι μεσολαβεί στον τρόπο σηματοδότησης της α2-μακροσφαιρίνης, της πρωτεΐνης του ανοσοποιητικού συστήματος που είναι φυλογενετικά πλησιέστερη στην πρωτεΐνη SIPC.