Διερεύνηση του ρόλου του μεταγραφικού παράγοντα Ets2 repressor factor (ERF) κατά την ωρίμανση και ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων

Abstract

ERF (ETS2 Repressor Factor) is a ubiquitously expressed transcriptional repressor of the ETS family that is regulated by subcellular localization as a result of Erk-dependent phosphorylation. It is well established that Erk1/2 plays an important role in T cell maturation and differentiation, however, its effectors are not well known. In the present dissertation, we studied the role of Erf, in vivo, in T cell maturation, using Erf floxed mice to produce thymus-specific ERF knockouts, and in vitro we studied ERF phosphorylation and function in the T cell line HuT78 over-expressing ERF. We observed statistically significant decreased numbers of CD4+ and TCRβ subpopulation and statistically significant elevated numbers of DP (CD4+CD8+) cells in the thymus of Erf deficient mice. Thus, our findings suggest that Erf is involved in T cell maturation at the DP stage, acting as a positive regulator during CD4 lineage commitment. Investigating the mechanism of Erf function, we focused on the expression of critical genes during lineage commitment and found that Gata3, ThPOK and Socs1 expression was statistically significant decreased in Erf deficient mice. Since those genes induce CD4 commitment, our findings are consistent with the hypothesis that Erf is a positive regulator of helper lineage commitment. Taking into consideration that Gata3 directly induces ThPOK expression and ThPOK regulates positively Socs1 expression, we propose that Erf acts as an upstream direct or indirect activator of Gata3. In an attempt to explore the possible impact of ERF in the biology of peripheral T lymphocytes, we studied the expression of ERF in the HuT78 cell line. Our results showed that ERF phosphorylation and subcellular localization is an Erk-dependent event. We also have indications that ERF act as a repressor of cell cycle. Finally, cells over-expressing ERF showed statistically significant lower IL-2 production, suggesting that ERF acts as a negative regulator of IL-2, something particularly interesting since IL-2 is a cytokine with broad range of immunological functions. Overall, our results show, for the first time, the possible involvement of ERF in T cell biology and can be the trigger for further research to understand thymocyte maturation and to comprehend the role of ERF in other immunological processes such as the differentiation of T helper cells (TH).

Ο μεταγραφικός παράγοντας ERF (Ets2 Repressor Factor, ERF), μέλος της οικογένειας των Ets γονιδίων, αποτελεί ένα μεταγραφικό καταστολέα, η ενεργότητα του οποίου ελέγχεται μέσω φωσφορυλίωσης από την Erk1/2, γεγονός που τροποποιεί την υποκυτταρική διαμερισματοποίησή του. Μολονότι η Erk1/2 έχει σημαντικό ρόλο στην ωρίμανση και τη διαφοροποίηση των Τ κυττάρων και ο ERF εκφράζεται στα Τ λεμφοκύτταρα, ο ρόλος του ERF στη βιολογία των Τ κυττάρων δεν έχει μελετηθεί. Στην παρούσα διατριβή μελετήσαμε το ρόλο του Erf στην ωρίμανση των Τ κυττάρων σε σύστημα διαγονιδιακών ποντικών μετά από ιστοειδική αποσιώπηση του Erf στο θύμο, ενώ σε ένα in vitro σύστημα χρησιμοποιώντας την κυτταρική σειρά HuT78 μελετήσαμε τη φωσφορυλίωση του ERF καθώς και το λειτουργικό του ρόλο μετά από υπερέκφραση. Τα αποτελέσματά μας παρέχουν βάσιμες ενδείξεις για τη συμμετοχή του Erf στη ρύθμιση της διαδικασίας καθώς διαγονιδιακοί ποντικοί με ιστοειδική αποσιώπηση του Erf στο θύμο παρουσίασαν στατιστικώς σημαντικά μειωμένα επίπεδα των κυτταρικών υποπληθυσμών CD4+ και TCRβ και στατιστικώς σημαντικά αυξημένα επίπεδα διπλά θετικών (CD4+CD8+) κυττάρων. Εν ολίγοις, υποδηλώνουν ότι ο Erf ρυθμίζει την ωρίμανση των θυμοκυττάρων κατά το στάδιο CD4+CD8+, πριν τη δέσμευση της κυτταρικής σειράς. Αναλύοντας το μοριακό μηχανισμό της δράσης του Erf, μελετήσαμε την έκφραση καίριων γονιδίων που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία και βρήκαμε ότι η έκφραση των γονιδίων Gata3, ThPOK και Socs1, γονιδίων δηλαδή που επάγουν τη CD4 κυτταρική δέσμευση, μειώνεται στατιστικώς σημαντικά στα ζώα με αποσιώπηση του Erf, γεγονός που συνηγορεί υπέρ της θετικής ρύθμισης του Erf στη CD4 δέσμευση των θυμοκυττάρων. Δεδομένης της διαδοχικής και επαγόμενης έκφρασης αυτών των γονιδίων (το Gata3 επάγει την έκφραση του ThPOK ενώ το δεύτερο μπορεί να επάγει την έκφραση του Socs1) υποθέτουμε ότι ο Erf δρα θετικά, άμεσα ή έμμεσα, και ανοδικά επί του Gata3. Για να ελέγξουμε με ποιο τρόπο ο ERF συμμετέχει στη βιολογία των περιφερικών Τ κυττάρων, μελετήσαμε την έκφρασή του σε HuT78 Τ κύτταρα και βρήκαμε ότι η φωσφορυλίωσή του και ο υποκυτταρικός εντοπισμός του είναι γεγονότα εξαρτώμενα της Erk1/2 ενώ έχουμε ενδείξεις ότι δρα ανασταλτικά στον κυτταρικό κύκλο. Τέλος, βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του ERF μειώνει στατιστικώς σημαντικά την παραγωγή της IL-2, γεγονός ιδιαίτερα ενδιαφέρον καθώς η IL-2 είναι κυτταροκίνη με ευρύ φάσμα δράσεων στο ανοσοποιητικό σύστημα. Συνολικά, η έρευνά μας αποτελεί την πρώτη ένδειξη ότι ο ERF εμπλέκεται στη βιολογία των Τ λεμφοκυττάρων αποτελώντας το έναυσμα για τη συνέχιση της μελέτης του ρόλου του ERF στη θυμοποίηση και σε άλλες διαδικασίες όπως η διαφοροποίηση των Τ βοηθητικών κυττάρων (ΤΗ).