Ανοσογενετική ανάλυση του ρεπερτορίου του Τ κυτταρικού υποδοχέα των κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων με αλληλούχηση υψηλής απόδοσης

Abstract

Introduction: Mono-, oligo- and poly- clonal expansions of CD3+CD8+CD57+ T-LGL may be either idiopathic or develop within the clinical context of several conditions e.g. autoimmunity, viral infections, post-transplant and in hematologic malignancies. Whether this heterogeneity reflects a dynamic process of cytotoxic T-cell responses against auto- and exoantigens remains to be established. Aim: The limited analytical depth of Sanger-based analysis has hindered firm conclusions from being drawn regarding the pathogenesis of these entities. In order to overcome these limitations and obtain insight into the role of antigenic drive in T-LGL lymphoproliferations, we here exploited high-throughput next generation sequencing (NGS) to interrogate the TRB gene repertoire. In the era of high throughput sequencing, our perceptions about immune responses will be revised. However, the absence of standardized experimental procedure and dedicated bioinformatics pipeline, special designed for immunogenetics data doesn’t ensure the repeatability of our results. Material and Methods: Included in the study were (i) a father and a son with T-LGL leukemia, the first case of intra-family occurrence; a single blood sample from the father and 2 samples from the son spanning 5 years were analyzed; and, (ii) a patient with T-LGL leukemia of donor cell origin developing after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT) for Philadelphia-positive acute lymphoblastic leukemia: and (iii) 13 well characterized Chronic Idiopathic Neutropenia (CIN) cases. TRBV-TRBJ-TRBD rearrangements were amplified on gDNA or/and cDNA and subjected to paired end NGS, covering the CDR3 twice/sequence. To increase the consistency of results, raw NGS reads were analyzed by a purpose-built bioinformatics algorithm, performing: (i) quality filtering, (ii) merging of filtered in paired reads and (iii) quality filter of stitched sequences. Filtered-in sequences were submitted to IMGT/HighV-QUEST, and metadata was processed by an in-house dedicated bioinformatics pipeline. Results: Major findings in all cases included: (i) pronounced skewing of the TRBV repertoire; (ii) existence of more than one immunodominant clonotype; (iii) persisting clonotypes in different timepoints albeit with fluctuating frequencies (clonal drift); and, (iv) shared (‘public’)clonotypes between cases and the public databases, further suggest a limited number of antigens implicated in pathogenesis of T-LGL cases.Conclusions: The borders between polyclonal versus oligoclonal versus monoclonal T-LGL lymphoproliferations are not sharply demarcated, but rather the transition from a polyclonal cytotoxic response to the development of T-LGL leukemia is a gradual process. Repertoire restrictions, public clonotypes and clonal drift strongly indicate selection by restricted (perhaps also shared) antigens in T-LGL leukemia ontogeny and evolution.

Εισαγωγή: Οι λεμφοϋπερπλασίες CD3+CD8+CD57+ μεγάλων Τ λεμφοκυττάρων με κοκκία (T-LGL) αναπτύσσονται σε ευρύ νοσολογικό ετερογενές φάσμα διαφόρων κλινικών οντοτήτων και χαρακτηρίζονται από επικάλυψη κλινικών συμπτωμάτων αλλά και εργαστηριακών ευρημάτων. Η ανοσογενετική ανάλυση των γονιδίων της β αλυσίδας του Τ κυτταρικού υποδοχέα των κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων των οντοτήτων αυτών αναδεικνύει ενδείξεις περί αντιγονικής εμπλοκής στην οντογένεση και πιθανώς εξέλιξη της νόσου. Σκοπός: Οι εγγενείς αδυναμίες της αλληλούχησης χαμηλής κλίμακας δεν μας επέτρεπαν την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων σχετικά με την παθογένεια των οντοτήτων. Η εφαρμογή μεθόδων αλληλούχησης υψηλής απόδοσης προσφέρει μία πληρέστερη εικόνα του ρεπερτορίου του Τ κυτταρικού υποδοχέα που θα ανασκευάσει τις απόψεις περί της σύστασης των άνοσων αποκρίσεων. Παρόλα αυτά, η έλλειψη προτυποιημένης πειραματικής διαδικασίας αλλά και βιοπληροφορικής ανάλυσης ειδικής για ανοσογενετικά δεδομένα δεν εξασφαλίζουν την επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων μας και την οριστική εξαγωγή συμπερασμάτων. Υλικά και μέθοδοι: Στην παρούσα μελέτη επιχειρήθηκε η προτυποποίηση της πειραματικής προσέγγισης αλλά και της βιοπληροφορικής ανάλυσης ανοσογενετικών δεδομένων τα οποία προκύπτουν με μεθόδους αλληλούχησης επόμενης γενιάς. Το προτυποποιημένο πειραματικό πρωτόκολλο εφαρμόσθηκε στη συνέχεια σε δείγματα (i) πατέρα και υιού με οικογενή T-LGL λευχαιμία (ii) ενός ασθενή με Ph+ALL που ανέπτυξε T-LGL λευχαιμία από τα κύτταρα του δότη μετά από αλλογενή μεταμόσχευση αιμοποιητικών κυττάρων (allo-HCT) και σε (iii) σε ασθενείς με Χρόνια Ιδιοπαθή Ουδετεροπενία (CIN), προκειμένου να αναζητηθούν περαιτέρω ανοσογενετικές μοριακές ενδείξεις για το ρόλο της επιλογής από αντιγόνο στις T-LGL λεμφοϋπερπλασίες. Αναδιατάξεις TRBV-TRBD-TRDJ ενισχύθηκαν από γενωμικό DNA ή/και cDNA με το πρωτόκολλο Biomed-2. Τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε paired-end πρωτόκολλο NGS (MiSeq Illumina). Η επεξεργασία των αλληλουχιών πραγματοποιήθηκε με εξειδικευμένο αλγόριθμο βιοπληροφορικής που περιλάμβανε: (i) ποιοτικά φίλτρα, (ii) σύνθεση των paired-end αλληλουχιών, (iii) προετοιμασία των συντεθειμένων αλληλουχιών για το εργαλείο IMGT/HighV-QUEST, και (iv) ομαδοποίηση και ερμηνεία των αποτελεσμάτων.Αποτελέσματα: Η ανάλυση των δεδομένων και στις τρεις περιπτώσεις κλινικών οντοτήτων επιβεβαιώνει : (i.) την επιλεκτικότητα του ρεπερτορίου, (ii.) την παρουσία δημόσιων κλωνότυπων και (iii.) τη διαχρονική παραμονή των εκπτυγμένων κλωνότυπων, δεδομένα που υπαινίσσονται ισχυρά επιλογή από περιορισμένο αριθμό αντιγόνων στην ανάπτυξη και πιθανώς εξέλιξη της T-LGL ανά περίπτωση. Συμπεράσματα: Τα όρια μεταξύ πολύ-, όλιγο-, μονο-, κλωνικότητας δεν είναι σαφώς οριοθετημένα. Η μετάβαση από μία πολυκλωνική κατάσταση σε μονοκλωνική εξαλλαγή των κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων είναι μία δυναμική, πολυπαραγοντική διαδικασία, με το μικροπεριβάλλον να διαδραματίζει βασικό ρόλο. Η ανοσογενετική μελέτη των κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων με μεθόδους αλληλούχησης υψηλής απόδοσης θα οδηγήσει στην αναθεώρηση των απόψεων περί σύστασης των άνοσων αποκρίσεων και θα προσφέρει ισχυρές ενδείξεις για την εμπλοκή αντιγόνου στη λεμφωματογένεση. Η φύση των αντιγόνων αυτών παραμένει να διευκρινιστεί.