Μοριακή ανάλυση της διαφορικής έκφρασης γονιδίων σε λεπιδόπτερα έντομα: μελέτη της «αρχιτεκτονικής» του υποκινητή του γονιδιακού ζεύγους A/B.L9 στο μεταξοσκώληκα Bombyx mori μέσω ηλεκτροδιάτρησης

Abstract

Gene expression, during development and differentiation, is controlled at the transcriptional and translational level. As far as transcriptional activation (the main subject of this thesis) is concerned, promoter (and/or enhancer) sequences “play” a very important role. A useful system for studying the molecular mechanisms, implicated in differential gene expression, is choriogenesis (eggshell formation) in Bombyx mori silkmoth. In particular, each developing ovariole includes a string of follicles, where each follicle represents a specific developmental phase. Although the follicle developmental differentiation is continuous, it is possible to divide choriogenesis into three stages (early, middle and late) according to the chorion gene expression patterns. In their vast majority, chorion genes of the same developmental specificity are organized in divergently-transcribed α/β gene pairs, sharing a common 5’ flanking promoter region (~250 bp). The primary aim of this thesis was to investigate how promoter “architecture” (number, orientation and position of transcriptional factor -C/EBP, GATA, HMGA, CHD1- binding sites) facilitates developmentally accurate chorion gene regulation. Towards this purpose, several mutated (and non-mutated) promoter regions of different developmental specificity chorion genes, were cloned upstream of a reporter gene (lacZ) to introduce these plasmid constructs into silkmoth follicle epithelial cells via electroporation as an efficient and quick method for transient expression (on ex vivo developing follicles). At first, electroporation parameters were optimized (250 Volts/cm current, 25 msec and 2-3 pulses duration using an electroporation buffer for cell cultures). RNA dot blot experiments on normal follicles, follicles incubated in Grace’s medium and follicles incubated in Grace’s medium after being electroporated confirmed that the above electroporation parameters could not affect the choriogenic developmental program of follicles during incubation in Grace’s medium. The same conclusion was drawn by comparing the expression patterns produced from constructs containing the p5H4, pEr1, p6F6.2, pL9, pL1 promoters in electroporation assays and the known transcription pattern produced by RNA dot blot experiments, respectively. Next, the impact of systematic cis-element- mutations on the A/B.L9 chorion gene promoter were tested in electroporation assays. Mutation of the GATA recognition site showed that the GATA factor behaves as an early repressor of middle chorion genes, since preventing its binding on the promoter resulted in earlier expression of the genes. Furthermore, mutation of the HMGA recognition site completely inactivated pL9, as expected. This validates the importance of the HMGA factor in the regulation of early-middle chorion gene expression, as HMGA not only causes bending of the A/B.L9 promoter but also recruits the C/EBP transcriptional factor to initiate transcription in either direction. The above expression patterns, produced from mutGATApL9-lacZ and mutHMGpL9-lacZ constructs, confirmed that the electroporation method can be used to deduce the role of specific binding sites in gene expression. Finally, mutation of each and every C/EBP binding site (in all possible combinations) on promoter pL9 revealed that two (out of four) C/EBP recognition sites, having the same orientation, are the most important for correct gene expression; the C/EBP2 site, which is preferred over the C/EBP1 one by the C/EBP protein, and the C/EBP4 because its mutation affects transcription. In contrast, the C/EBP3 site seemed to be “neutral”. In this thesis, a revised model is proposed for the developmentally accurate regulation of the A/B.L9 chorion genes. This model comprises a strict binding “program” of the previously mentioned transcription factors on cis-regulatory elements, whose access is dependent on two nucleosomes located on the promoter.

Η γονιδιακή έκφραση, κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και διαφοροποίησης, ελέγχεται τόσο σε μεταγραφικό όσο και σε μεταφραστικό επίπεδο. Όσον αφορά τη μεταγραφική ενεργοποίηση, που αποτελεί κύριο θέμα της παρούσας διατριβής, εξαρτάται σε πολύ σημαντικό βαθμό από τις αλληλουχίες των υποκινητών (ή/και των ενισχυτών). Η μελέτη των πολύπλοκων μοριακών μηχανισμών, που εμπλέκονται στη διαφορική γονιδιακή έκφραση, προϋποθέτει τη χρήση κατάλληλων συστημάτων-μοντέλων και ως ένα τέτοιο έχει αναδειχθεί το σύστημα της χοριογένεσης (σχηματισμός κελύφους του αυγού) στο μεταξοσκώληκα Bombyx mori. Συγκεκριμένα, κάθε ένα από τα οκτώ ωοθηκάρια του μεταξοσκώληκα περιλαμβάνει μια σειρά διαδοχικά αναπτυσσόμενων ωοθυλακίων και έτσι κάθε ωοθυλάκιο αντιπροσωπεύει ένα αναπτυξιακό στάδιο. Παρόλο που η αναπτυξιακή διαφοροποίηση των ωοθυλακίων είναι συνεχής, είναι δυνατή μια συμβατική διαίρεση της όλης πορείας σε τρία στάδια (πρώιμα, ενδιάμεσα και όψιμα) με βάση το γενικό πρότυπο έκφρασης των αντίστοιχων γονιδίων του χορίου. Στην πλειοψηφία τους, τα γονίδια του χορίου είναι οργανωμένα σε ζεύγη (α και β τύπου) ίδιας αναπτυξιακής εξειδίκευσης, με αντιπαράλληλη κατεύθυνση μεταγραφής και κοινή 5' ρυθμιστική περιοχή (~250 ζεύγη βάσεων).Σκοπό της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η μελέτη της «αρχιτεκτονικής» των υποκινητών, δηλαδή πώς συνδράμουν στην αναπτυξιακή εξειδίκευση της έκφρασης των γονιδίων του χορίου οι συγκεκριμένες θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων (C/EBP, GATA, HMGA, CHD1), ο προσανατολισμός τους, ο αριθμός τους ακόμα και οι μεταξύ τους σχετικές αποστάσεις. Ως βασική μέθοδο προσέγγισης, επιλέξαμε την τεχνική της ηλεκτροδιάτρησης (electroporation) μέσω της οποίας καθίσταται εφικτή η επιτυχής εισαγωγή και έκφραση γονιδιακών κατασκευών στα επιθηλιακά κύτταρα των ωοθυλακίων του μεταξοσκώληκα Bombyx mori. Οι κατασκευές αυτές είναι τμήματα ανασυνδυασμένου DNA που περιέχουν το γονίδιο αναφοράς lacZ, υπό τον έλεγχο άρτιων ή/και τροποποιημένων υποκινητών αντιπροσωπευτικών γονιδίων του χορίου. Η όλη προσέγγιση προσομοιάζει την in vivo κατάσταση. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση των παραμέτρων ηλεκτροδιάτρησης, καταλήγοντας στις παρακάτω συνθήκες: ένταση του ηλεκτρικού πεδίου 250 Volt/cm, συνολική διάρκεια των ηλεκτρικών παλμών 25 msec - (2–3) παλμοί και το διάλυμα ηλεκτροδιάτρησης για κυτταροκαλλιέργειες ως το μέσο στο οποίο εφαρμόζεται το ηλεκτρικό ρεύμα. Επιβεβαίωση ότι οι παραπάνω συνθήκες ηλεκτροδιάτρησης δεν επηρεάζουν το αναπτυξιακό πρόγραμμα της χοριογένεσης των ωοθυλακίων καθώς αναπτύσσονται σε in vitro καλλιέργειες, προήλθε από πειράματα ανάλυσης κηλίδων RNA με χρήση μη κατεργασμένων ωοθυλακίων, ωοθυλακίων που επωάστηκαν σε θρεπτικό υλικό και ωοθυλακίων που επωάστηκαν σε θρεπτικό υλικό μετά από εφαρμογή ηλεκτρικών παλμών. Το ίδιο συμπέρασμα προέκυψε έπειτα από σύγκριση των προτύπων έκφρασης, μέσω ηλεκτροδιάτρησης, των γονιδιακών κατασκευών με τους άρτιους (πλήρους μήκους) υποκινητές p5H4, pEr1, p6F6.2, pL9, pL1 και των προτύπων μεταγραφής των αντίστοιχων γονιδίων, μέσω πειραμάτων ανάλυσης κηλίδων RNA, που είναι γνωστά από τη βιβλιογραφία. Στη συνέχεια, μελετήθηκε ο ρόλος της «αρχιτεκτονικής» του «διφασικού» υποκινητή του γονιδιακού ζεύγους Α/Β.L9 στη ρύθμιση της μεταγραφής, προς οποιαδήποτε κατεύθυνση. Για τον σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα ηλεκτροδιάτρησης γονιδιακές κατασκευές του υποκινητή pL9, μεταλλαγμένου σε διάφορες θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων. Μεταλλαγή της θέσης πρόσδεσης GATA έδειξε ότι ο παράγοντας δρα ως καταστολέας της έκφρασης, κατά τα πρώιμα στάδια της χοριογένεσης, στον υποκινητή pL9. Επιπλέον, μεταλλαγή των θέσεων πρόσδεσης του παράγοντα HMGA κατέστησε τον υποκινητή ανίκανο να ενεργοποιήσει τη μεταγραφή σε οποιοδήποτε αναπτυξιακό στάδιο. Το αποτέλεσμα αυτό ήταν αναμενόμενο, καθώς ο μεταγραφικός παράγοντας HMGA έχει δειχθεί ότι είναι υπεύθυνος τόσο για την κάμψη του υποκινητή όσο και για την προσέλκυση του «ενεργοποιητικού» παράγοντα C/EBP, επιβεβαιώνοντας, με αυτόν τον τρόπο, τον σημαντικό ρόλο που διαδραματίζει στην έναρξη της μεταγραφής των αντίστοιχων γονιδίων του χορίου. Τα δύο αυτά αποτελέσματα αποτέλεσαν, επίσης, απόδειξη ότι η μέθοδος της ηλεκτροδιάτρησης μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως εργαλείο για τη μελέτη του ρόλου των cis- ρυθμιστικών στοιχείων ενός υποκινητή, εφόσον γίνεται σύγκριση μόνο των προτύπων έκφρασης που προκύπτουν από τις διαφορετικές παραλλαγές του ιδίου υποκινητή μεταξύ τους. Τέλος, μεταλλαγή σε μεμονωμένες θέσεις πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα C/EBP (αλλά και σε συνδυασμούς αυτών) έδειξε ότι από τις τέσσερις θέσεις C/EBP, που εντοπίζονται στον συγκεκριμένο υποκινητή, δύο είναι οι πιο σημαντικές (με αξιοσημείωτο το γεγονός ότι έχουν τον ίδιο προσανατολισμό): (α) Η θέση C/EBP2, η οποία «προτιμάται» έναντι της θέσης C/EBP1 (η κοντινή τους απόσταση δεν επιτρέπει την ταυτόχρονη πρόσδεση της πρωτεΐνης και στις δύο θέσεις), και (β) Η θέση C/EBP4, καθώς η μεταλλαγή της επηρεάζει την ενεργοποίηση της μεταγραφής σε αντίθεση με τη θέση C/EBP3, της οποίας ο ρόλος αποδείχτηκε ότι είναι «ουδέτερος». Από την παρούσα διατριβή προέκυψε ένα αναθεωρημένο πρότυπο για τη σωστή αναπτυξιακή ρύθμιση των Α/Β.L9 γονιδίων. Το πρότυπο αυτό περιλαμβάνει ένα αυστηρό πρόγραμμα πρόσδεσης -των προαναφερθέντων- μεταγραφικών παραγόντων σε συγκεκριμένα cis-ρυθμιστικά στοιχεία, των οποίων η προσβασιμότητα εξαρτάται από δύο νουκλεοσώματα, παρόντα στον υποκινητή.