Μοριακή προσέγγιση δομικών και λειτουργικών στοιχείων του μιτοχονδριακού DNA του Mytilus galloprovincialis

Abstract

The Doubly Uniparental Inheritance (DUI) phenomenon is a unique feature in theanimal kingdom. It is the only case of systematic violation of the general rule of uniparental(maternal) inheritance of mitochondrial DNA. DUI has been detected in over 50 species ofbivalve molluscs. In these species, two types of mitochondrial genomes exist, the F and the M.The two genomes exhibit the same gene organization but differ in nucleotide sequence at asignificant level, which varies from species to species. The maternal mitochondrial DNA (Ftype) is transmitted to the female offspring, and hence its eggs. On the other hand, the paternalmitochondrial DNA (M type), which according to the Strictly Maternal Inheritance observedin the majority of animal species should be destroyed in the zygote, in species with DUI notonly is it not destroyed, but it is also systematically transmitted to the germ line of the maleoffspring, and therefore to its mature sperm.The primary aim of this thesis was the investigation of the mechanism by which theelimination of F and the retention of the M genome is accomplished in male germ line. Themost abundant species with DUI in Greece, Mytilus galloprovincialis, was used as the animalmodel of this study.An extensive in silico analysis of F and M mitochondrial DNA sequences, using theexisting literature data, indicated a part of the first variable domain (VD1) of the main controlregion (CR) as the most promising site of sequences that are involved in the inheritance ofeach genome type. The nucleotide sequence of VD1 is highly different between F and M. TheCR is located between l-rRNA and tRNATyr genes and has a tripartite structure: a conserveddomain (CD) in-between two variable domains (VD1 and VD2).According to the literature, there is an open reading frame (ORF) in VD1 of the Fgenome of Mytilus, which might code for a protein product. An ORF has also been detected,according to the literature, in the VD1 of the M. During the present study, evidence occurred,that argues against the involvement of these ORFs in the mechanism of elimination of the F in mature sperm.Therefore, we searched for possible binding sites for nucleus-coded protein factors,which are responsible for the regulation of the inheritance of the genomes. In silico analysis ofVD1 sequences from various Mytilus species, in combination with existing literature data,revealed a sequence of 152 bp (VD1-M161-312) in the M genome, which is probably involved inthe mode of inheritance of the M. Presumably, this sequence is a cis-element, namely a binding site for trans-acting protein factors. This hypothesis was examined by acomprehensive series of Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) experiments. Theformation of a stable complex was observed between VD1-M161-312, which was used as aprobe, and a protein extract from a male gonad. This complex was not formed when theprotein extract originated from a female gonad or from a somatic tissue (foot) of either a maleor a female individual. Therefore, the factor/s that participates in the complex is both sexspecificand tissue-specific. The presence of two retarded bands in the EMSA experimentsuggests the binding of two factors to the probe (each of which could be itself a proteincomplex). It is not known, however, whether the two factors are identical (homodimer) ordifferent (heterodimer). Another interesting observation is that the protein factors of thecomplex originate from the nuclear and not from the cytoplasmic extract, as expected. Thiscan be explained, since perinuclear mitochondria were found in the nuclear extract. Accordingto the literature, it is not the first time that perinuclear mitochondria play a distinctive role,besides oxidative phosphorylation. Subsequently, competitor EMSA experiments confirmedthe specificity as well as the stability of the complex. In an attempt to find a shorter part ofVD1-M161-312 that provides a similar result in EMSA experiments, fragment VD1-M180-255 wasobtained, which consists of a sequence of 26 adenines approximately in the middle, a 27 bpsequence upstream from the adenine tract, and a 23 bp sequence downstream from the adeninetract. A DNase I footprinting experiment showed that the binding element of VD1-M161-312 liesin the 23 bp sequence. Further EMSA experiments employed for the investigation of the roleof these sequences, led to the formulation of the following model describing the formation ofthe complex: the adenine sequence probably bends, thus allowing the binding of the firstsubunit of the dimer to the binding element. A special and original role is attributed to the 27bp sequence upstream from the adenine tract, which is necessary for the stabilization andretention of the complex. Hereupon, the binding of the second subunit completes the dimer.Complex formation most probably protects the M genome and thus paternal mitochondriafrom degradation in the sperm.The VD1 of the F genome was also investigated for the presence of a protein bindingsite. Indeed, a complex was formed between a certain VD1 probe and a male gonad protein extract, which nonetheless was fairly weak, with an unsatisfying repeatability and specificity.Therefore, this complex is probably not formed in vivo. Moreover, since the F genome doesnot possess a sequence similar to VD1-M180-255 of the M, it cannot form the correspondingprotection complex and is thus eliminated from the sperm line, through degradation of thematernal mitochondria.During the investigation of the functionality of the ORFs in the F- and M-type VD1,polyadenylated transcripts of different lengths were found, corresponding to the main controlregion. In a further study of transcripts of non-protein-coding genes, truncated, polyadenylated or non-adenylated transcripts of rRNA genes were found, as well as polyadenylated after theaddition of CCA, tRNA transcripts. All these polyadenylated but non-functional transcriptsand transcript residues, which arise from the way mitochondrial transcription is performed,evince the existence of a degradosome in Mytilus mitochondria. Moreover, these series ofexperiments revealed that the 3’ end of l-rRNA gene is located 49 nucleotides upstream fromthe initially annotated end. Thus the 49 excessive nucleotides eventually belong to the CR thatfollows the forementioned gene.Finally, in an initial attempt to reveal the factors that bind to the VD1 of the Mgenome, a protein family (forkhead proteins) was detected through in silico analysis, whichseems to recognize the motif of the binding element in VD1. Indeed, according to an earlierstudy, a member of this family, Foxl2, was detected in a bivalve mollusc without DUI. In thisspecies, Foxl2 is involved in sex determination and gonadal maturation. In the framework ofthe present thesis, a part of the Foxl2 sequence was obtained from the nuclear genome ofMytilus and as a future goal, the determination of its expression and the study of the respectivetranscript and protein product, is desired.

To φαινόμενο της Διπλής Μονογονεϊκής Κληρονομικότητας (ΔΜΚ) αποτελεί μια ιδιαιτερότητα στο ζωικό βασίλειο. Είναι η μοναδική περίπτωση συστηματικής παραβίασης του γενικού κανόνα της μονογονεϊκής (μητρικής) κληρονόμησης του μιτοχονδριακού DNA. Η ΔΜΚ έχει ανιχνευτεί σε περισσότερα από 50 είδη διθύρων μαλακίων. Στα είδη αυτά υπάρχουν δύο τύποι μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων, F και Μ, τα οποία παρουσιάζουν ίδια γονιδιακή οργάνωση αλλά διαφέρουν στη νουκλεοτιδική αλληλουχία σε σημαντικό βαθμό που ποικίλει από είδος σε είδος. Το μητρικό μιτοχονδριακό DNA (τύπος F) μεταβιβάζεται σε ολόκληρο τον θηλυκό απόγονο και κατ’ επέκταση στα αυγά του. Από την άλλη, το πατρικό μιτοχονδριακό DNA (τύπος Μ), το οποίο σύμφωνα με την Αυστηρά Μητρική Κληρονόμηση που παρατηρείται στην πλειοψηφία των ζωικών ειδών, θα έπρεπε να καταστρέφεται στο ζυγωτό,στα είδη με ΔΜΚ όχι μόνο δεν καταστρέφεται, αλλά μεταβιβάζεται συστηματικά στη σπερματική γραμμή του αρσενικού απογόνου και κατ’ επέκταση στα ώριμα σπερματοζωάριά του. Στόχο της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση του μηχανισμού με τον οποίο επιτυγχάνεται η εξάλειψη του γονιδιώματος F και η διατήρηση του Μ στη σπερματική γραμμή του αρσενικού ατόμου. Ως πειραματόζωο χρησιμοποιήθηκε το πιο άφθονο είδος με ΔΜΚ στην Ελλάδα, το μύδι Mytilus galloprovincialis. Εκτενής in silico ανάλυση αλληλουχιών μιτοχονδριακού DNA τύπου F και Μ από υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα υπέδειξε μέρος της πρώτης μεταβλητής περιοχής (VD1)της κύριας ρυθμιστικής περιοχής (CR) ως την πιθανότερη θέση αλληλουχιών που εμπλέκονται στην κληρονόμηση του κάθε τύπου γονιδιώματος. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία του VD1 διαφέρει σε μεγάλο βαθμό μεταξύ των F και Μ. Το CR βρίσκεται μεταξύ των γονιδίων l-rRNAκαι tRNATyr και έχει τριμερή δομή: μια συντηρητική περιοχή (CD) με δύο μεταβλητές περιοχές (VD1 και VD2) εκατέρωθεν αυτής. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, στο VD1 του γονιδιώματος F του Mytilus υπάρχει ένα ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης (ORF) το οποίο πιθανόν να κωδικοποιεί πρωτεΐνη. Ένα ORF έχει επίσης εντοπιστεί σύμφωνα με τη βιβλιογραφία και στο VD1 του Μ. Κατά την διάρκεια της παρούσας μελέτης προέκυψαν στοιχεία που συνηγορούν κατά της υπόθεσης της εμπλοκής αυτών των ORF στο μηχανισμό απάλειψης του F από το σπέρμα.Κατά συνέπεια στραφήκαμε στην αναζήτηση πιθανών θέσεων πρόσδεσης πυρηνικών πρωτεϊνικών παραγόντων για τη ρύθμιση της κληρονόμησης των γονιδιωμάτων. Από την insilico ανάλυση αλληλουχιών VD1 από διάφορα είδη Mytilus και σε συνδυασμό με υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα, εντοπίστηκε στο γονιδίωμα Μ μια αλληλουχία 152 bp (VD1-M161-312) η οποία πιθανότατα εμπλέκεται στην κληρονόμηση του γονιδιώματος Μ. Υποτέθηκε ότι η αλληλουχία αυτή αποτελεί cis-στοιχείο, δηλαδή θέση πρόσδεσης trans-πρωτεϊνικών παραγόντων. Η υπόθεση αυτή εξετάστηκε με διεξοδική σειρά πειραμάτων Μείωσης Κινητικότητας Συμπλόκου (EMSA). Παρατηρήθηκε σχηματισμός σταθερού συμπλόκου τουVD1-M161-312 που χρησιμοποιήθηκε ως ανιχνευτής, με πρωτεϊνικό εκχύλισμα γονάδας αρσενικού ατόμου. Σχηματισμός συμπλόκου δεν υπήρξε στην περίπτωση που το πρωτεϊνικό εκχύλισμα προερχόταν από γονάδα θηλυκού ατόμου ή από σωματικό ιστό (πόδι) αρσενικού ή θηλυκού ατόμου. Συνεπώς, πρόκειται για παράγοντα/ες που δρα/ουν φυλο-ειδικά αλλά και ιστο-ειδικά. Η παρουσία δύο ζωνών συμπλόκου στο πείραμα EMSA, υποδηλώνει την πρόσδεση δύο παραγόντων (όπου ο κάθε παράγοντας θα μπορούσε να είναι ένα σύμπλοκο πρωτεϊνών) στον ανιχνευτή. Δεν είναι γνωστό, ωστόσο, εάν πρόκειται για δύο ίδιους παράγοντες (ομοδιμερές) ή για διαφορετικούς (ετεροδιμερές). Ιδιαίτερο εύρημα αποτελεί επίσης το γεγονός ότι οι παράγοντες του συμπλόκου προέρχονται από το πυρηνικό κλάσμα και όχι από το κυτταροπλασματικό, όπως θα αναμενόταν. Αυτό εξηγείται από το γεγονός ότι στο πυρηνικό κλάσμα βρέθηκαν περιπυρηνικά μιτοχόνδρια. Με βάση τη βιβλιογραφία, δεν είναι η πρώτη φορά που τα περιπυρηνικά μιτοχόνδρια διαδραματίζουν έναν ξεχωριστό ρόλο,πέραν της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. Ακολούθησαν πειράματα EMSA ανταγωνισμού που επιβεβαίωσαν την ειδικότητα αλλά και τη σταθερότητα του συμπλόκου. Σε προσπάθεια εύρεσης μικρότερου τμήματος του VD1-M161-312 που δίνει όμοια εικόνα σε πείραμα EMSA,προέκυψε το τμήμα VD1-M180-255, το οποίο περιλαμβάνει μια αλληλουχία 26 αδενινών περίπου στο μέσο του, αλληλουχία 27 bp στα αριστερά της και μια αλληλουχία 23 bp στα δεξιά της. Με πείραμα αποτυπώματος DNase Ι βρέθηκε ότι στην αλληλουχία των 23 bp μετά τις αδενίνες, εντοπίζεται το στοιχείο πρόσδεσης του VD1-M161-312. Περαιτέρω πειράματαEMSA για την εξιχνίαση του ρόλου αυτών των επιμέρους αλληλουχιών, οδήγησαν στη διατύπωση του εξής μοντέλου για το σχηματισμό του συμπλόκου: η αλληλουχία των αδενινών κατά πάσα πιθανότητα κάμπτεται, επιτρέποντας έτσι την πρόσδεση της πρώτης υπομονάδας του διμερούς παράγοντα στο στοιχείο πρόσδεσης. Ιδιαίτερος και πρωτότυπος είναι ο ρόλος της αλληλουχίας στα αριστερά των αδενινών, η οποία είναι απαραίτητη για τη σταθεροποίηση και συγκράτηση του συμπλόκου. Ακολουθεί και η πρόσδεση της δεύτερης υπομονάδας για την ολοκλήρωση του διμερούς. Ο σχηματισμός του συμπλόκου, κατά πάσα πιθανότητα προστατεύει το γονιδίωμα Μ και κατ’ επέκταση τα πατρικά μιτοχόνδρια από την αποικοδόμηση στο σπέρμα.Θέση πρόσδεσης παραγόντων αναζητήθηκε και στο VD1 του γονιδιώματος F με πείραμα EMSA. Πράγματι σχηματίστηκε σύμπλοκο συγκεκριμένου ανιχνευτή από το VD1 με εκχύλισμα γονάδας αρσενικού ατόμου, το οποίο όμως ήταν αρκετά ασθενές, με μη ικανοποιητική επαναληψιμότητα και ειδικότητα. Επομένως, πιθανότατα το εν λόγω σύμπλοκο να μη σχηματίζεται in vivo. Επίσης, εφόσον το γονιδίωμα F δε διαθέτει αλληλουχία παρόμοια με το VD1-M180-255 του Μ, δεν μπορεί να σχηματίσει αντίστοιχο σύμπλοκο προστασίας και συνεπώς εξαλείφεται από τη σπερματική γραμμή μέσω αποικοδόμησης των μητρικών μιτοχονδρίων. Κατά τη διερεύνηση της λειτουργικότητας των ORF στο VD1 των F και Μ βρέθηκαν πολυαδενυλιωμένα μετάγραφα διαφόρων μεγεθών από την κύρια ρυθμιστική περιοχή. Σε ευρύτερη μελέτη μεταγράφων μη-πρωτεϊνικών γονιδίων, βρέθηκαν επίσης κομμένα, πολυαδενυλιωμένα ή μη μετάγραφα των rRNA γονιδίων, καθώς επίσης και tRNA μετάγραφα πολυαδενυλιωμένα μετά την προσθήκη του CCA. Όλα αυτά τα πολυαδενυλιωμένα μεν, μη λειτουργικά δε, μετάγραφα και απομεινάρια μεταγράφων που προκύπτουν από τον τρόπο που γίνεται η μεταγραφή στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα, μαρτυρούν τη δράση αποικοδομοσώματος στα μιτοχόνδρια του Mytilus. Επίσης σε αυτή τη σειρά πειραμάτων απεδείχθη ότι το 3’ άκρο του γονιδίου του l-rRNA βρίσκεται 49 νουκλεοτίδια πριν από το αρχικά ορισμένο άκρο.Επομένως τα 49 νουκλεοτίδια που περισσεύουν, ανήκουν τελικά στο CR, που έπεται του εν λόγω γονιδίου.Tέλος, σε μια πρώτη προσπάθεια εύρεσης των παραγόντων που προσδένονται στοVD1 του γονιδιώματος Μ, εντοπίστηκε με in silico ανάλυση, μια οικογένεια πρωτεϊνών(forkhead proteins), που αναγνωρίζουν το μοτίβο του στοιχείου πρόσδεσης στο VD1.Μάλιστα, ένα μέλος της οικογένειας αυτής, το Foxl2, ανιχνεύτηκε σε παλαιότερη μελέτη, σε ένα δίθυρο μαλάκιο χωρίς ΔΜΚ. Στο είδος αυτό, το Foxl2 εμπλεκόταν στον φυλοκαθορισμό και την ωρίμανση των γονάδων. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής έγινε εφικτή η εύρεση ενός τμήματος της αλληλουχίας του Foxl2 στο πυρηνικό γονιδίωμα του Mytilus και αποτελεί μελλοντικό στόχο η διαπίστωση της έκφρασής του και η μελέτη μεταγράφου και πρωτεΐνης