Stochastic aspects of chromatin and nuclear envelope dynamics in mouse embryonic stem cells

Abstract

Differentiation of embryonic stem cells is associated with progressive immobilization of chromatin proteins, increase in the relative proportions of heterochromatin and decline of global transcriptional activity. Although these events signify the gradual transition from “open” to “closed” chromatin states, hundreds of genes are de-repressed or activated during lineage commitment, suggesting differential remodeling of the chromatin landscape. Using a FRAP/FLIP-based approach in combination to live cell imaging, we have shown here that the mobility of chromatin proteins is not bijectively related to exit from pluripotency or activation of lineage-specific genes at the level of single cells. Comparison of dynamic ensembles further reveals the occurrence of random spatio-temporal fluctuations, which continuously scramble the chromatin landscape and create a “shifting mosaic steady-state” across and within heterochromatic domains. Apparently, less dynamic chromatin forms become increasingly more stable and more abundant as cells transit from one attractor state to the next, allowing subtle –yet, fate-determining- changes in gene expression mode, while maintaining a significant degree of developmental plasticity.New evidence implicates the nuclear envelope in the control of gene expression and the orderly progress of differentiation. Elaborating on this theme, we have overexpressed and knocked-out the polytopic membrane protein lamin B receptor (LBR) in mouse embryonic stem cells and studied the functional consequences at the cellular and the molecular level. The results show that increased LBR dosage limits the dynamic range of Nanog fluctuations and shifts naïve ESCs towards a primed metastate. This shift is paralleled by dramatic changes in expression profile and a mesendodermal differentiation impairment. Although the inappropriate expression of LBR does not lead to exit from the undifferentiated state, increased LBR dosage causes defects in embryoid body formation and inappropriate expression of lineage-specific markers upon induction of differentiation, suggesting involvement of this protein in critical cell fate decisions.

Η διαδικασία διαφοροποίησης των εμβρυονικών βλαστικών κυττάρων συσχετίζεται με μία προοδευτική «ακινητοποίηση» της χρωματίνης, αύξηση των σχετικών επιπέδων ετεροχρωματίνης και μείωση της μεταγραφικής δραστηριότητας. Παρόλο που τα γεγονότα αυτά σηματοδοτούν τη σταδιακή μετάβαση από «κλειστές» σε «ανοιχτές» χρωματινικές καταστάσεις, πληθώρα γονιδίων επηρεάζεται κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαφοροποίησης, υποδηλώνοντας μία διαφορική αναδιαμόρφωση του χρωματινικού τοπίου. Χρησιμοποιώντας προσεγγίσεις που βασίστηκαν στις μεθόδους FRAP/FLIP σε συνδυασμό με παρατήρηση ζωντανών κυττάρων στο συνεστιακό μικροσκόπιο, αποδείξαμε πως η δυναμική των πρωτεϊνών της χρωματίνης δεν συσχετίζεται άμεσα με την έξοδο από την πολυδύναμη κατάσταση ή την ενεργοποίηση γονιδίων διαφοροποίησης. Επίσης, παρατηρήθηκαν στοχαστικές διακυμάνσεις των δυναμικών καταστάσεων, οι οποίες οδηγούσαν σε ανακατάταξη του χρωματινικού τοπίου και δημιουργούσαν ένα χρωματινικό μωσαϊκό κατά μήκος, αλλά και στο εσωτερικό των ετεροχρωματινικών εστιών. Όπως αναμενόταν, λιγότερο δυναμικές μορφές χρωματίνης σταθεροποιήθηκαν και αυξήθηκαν σε συχνότητα, κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης, επιτρέποντας με αυτόν τον τρόπο αλλαγές στην έκφραση γονιδίων, διατηρώντας παράλληλα σε ένα σημαντικό βαθμό το αναπτυξιακό δυναμικό.Βιβλιογραφικά δεδομένα έχουν αναδείξει την εμπλοκή του πυρηνικού φακέλου στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης και στην ορθή εξέλιξη της διαφοροποίησης. Διερευνώντας το συγκεκριμένο θέμα, δημιουργήσαμε σειρές εμβρυονικών βλαστικών κυττάρων που υπερεκφράζουν τον υποδοχέα της λαμίνης Β LBR και σειρές στις οποίες το μόριο αυτό έχει απαλειφθεί. Στη συνέχεια, μελετήσαμε τις λειτουργικές συνέπειες τόσο σε κυτταρικό όσο και σε μοριακό επίπεδο. Τα αποτελέσματα δείχνουν πως η αύξηση των επιπέδων του LBR μειώνει το εύρος διακυμάνσεων του NANOG και απομακρύνει τα κύτταρα από την πολυδυναμία. Παρά το γεγονός πως η αύξηση αυτή δεν οδηγεί σε ξεκάθαρη έξοδο από την αδιαφοροποίητη κατάσταση, προκαλεί σημαντικές αλλαγές στην έκφραση ιστο-ειδικών δεικτών, υποδηλώνοντας την πιθανή συμμετοχή της πρωτεϊνης στις αποφάσεις της κυτταρικής μοίρας.