Ρόλος και μηχανισμοί διακυτταρικών συνδέσεων στη λειτουργία του ενδοθηλιακού φραγμού

Abstract

This work focuses on the study of the properties of transmembrane and juxtamembrane domain of ve-cadherin (ve-c) in a special lipid microenvironment and on its functions for the assembly of adherens junctions at the endothelium. First, we examined the hypothesis if ve-c is located in special lipid microdomains of the plasma membrane. The results of this study showed that ve-c is located in lipid microdomains of the membrane which are characterized by the presence of cholesterol and pip2. The fact that ve-c colocalises at great extend with pip2 at the plasma membrane is revealed for the first time. This was confirmed by two independent experimental approaches: morphological colocalisation analysis of ve-cadherin mcherry and ph-gfp after immunofluorescence and in vivo crosslinking, a biochemical approach. The relationship between ve-cadherin and pip2 was confirmed also functionally : downregulation of pip2 after induction of iv 5-ptase at the membrane inhibits the assembly of adherens junctions . Also, its inactivation at the membrane had the same effect. Cdc42, a member of the family of rhogtpases is among the proteins that when they are activated they bind to pip2 and they promote the assembly of adherens junctions. In this way cdc42 is involved in the function of endothelial barrier as the principal receiver of a mechanism that includes the induction of actin polymerization, but upstream events have not been elucidated yet. Given the fact that ve-cadherin accumulates pip2, whether ve-cadherin has the same action as far as cdc42 is concerned, was further examined. It was observed that at the presence of p120, ve-cadherin participates at the recruitment of cdc42 at the membrane where ve-cadherin is located. Also, there isn’t direct interaction between ve-cadherin complex and cdc42. Among the possible candidate scaffold proteins between ve-cadherin and cdc42 that were examined was iqgap. Iqgap coprecipitates with ve-cadherin complex. At this work data which broaden the known structural and functional properties of ve-cadherin at the plasma membrane is presented. In particular, the presence of ve-cadherin causes the accumulation of pip2, of the signaling molecule cdc42 and possibly of microtubules. These results shed light at the role of actin dynamics at the assembly of adherens junctions and they introduce the importance of microtubules at this process for the first time. Based on these results unknown functions of ve-cadherin at adhesion and signaling will be examined in the future.

Η παρούσα διατριβή εστιάζεται στη μελέτη των ιδιοτήτων της διαμεμβρανικής και της παραπλεύρως της μεμβράνης περιοχής της ve-cadherin στο λιπιδιακό μικροπεριβάλλον και στις λειτουργίες του για το σχηματισμό των διακυτταρικών συνδέσεων στο ενδοθήλιο. Αρχικά εξετάστηκε το ενδεχόμενο η ve-cadherin να εντοπίζεται σε λιπιδιακες μικροπεριοχες της πλασματικής μεμβράνης. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι η ve-cadherin εντοπίζεται σε λιπιδιακες μικροπεριοχες της μεμβράνης που χαρακτηρίζονται απο την παρουσία χοληστερόλης καθώς και pip2. Συνεπώς διευκρινίζεται για πρώτη φορά οτι η ve-cadherin συνεντοπιζεται σε σημαντικό βαθμό συγκεκριμένα με το φωσφολιπιδιο pip2 στην περιοχή της πλασματικής μεμβράνης. Αυτό επετευχθη με δυο ανεξάρτητες μεθόδους: με μορφολογικό συνεντοπισμο της ve-cadherin-mcherry/ph-gfp μετά από άμεσο ανοσοφθορισμο και βιοχημικά με τη χρήση χημικής διασύνδεσης in vivo. Η σχεση ve-cadherin και pip2 επιβεβαιωθηκε επισης λειτουργικα: ελεγχομενη μειορυθμιση των επιπεδων του pip2 μεσω επαγωγης της λιπιδιακης φωσφατασης iv 5-ptase στη μεμβρανη ανεστειλε το σχηματισμο των συνδεσμων. Το ιδιο αποτελεσμα ειχε η αδρανοποιηση του στη μεμβρανη. Μεταξυ των πρωτεϊνων που οταν ενεργοποιηθουν συνδεονται με το pip2 και προαγουν τον σχηματισμο των συνδεσμων προσκολλησης ειναι η cdc42, μελος της οικογενειας των rho gtpασων. Με αυτο τον τροπο η cdc42 εμπλεκεται στη λειτουργια του ενδοθηλιακου φραγμου ως βασικος αποδεκτης ενος μηχανισμου που περιλαμβανει την επαγωγη του πολυμερισμου της ακτινης, αλλα τα ανοδικα σταδια ειναι δεν ειναι γνωστα. Δεδομενου οτι η εκφραση της ve-cadherin συγκεντρωνει pip2 εξετασθηκε στη συνεχεια εαν εχει την ιδια δραση οσον αφορα την cdc42. Παρατηρηθηκε οτι η vec παρουσια της p120, αλλα οχι της β-κατενινης, συμμετεχει στη στρατολογηση της cdc42 στην περιοχη της κυτταροπλασματικης μεμβρανης που βρισκεται η ve-cadherin. Παραταυτα δεν υπαρχει αμεση συνδεση μεταξυ του συμπλοκου της ve-cadherin με την cdc42. Αναμεσα στις πιθανες πρωτεϊνες-διασυνδετες μεταξυ ve-cadherin και cdc42 εξετασθηκε η iqgap η οποια βρεθηκε οτι συγκατακρημνιζεται με το συμπλοκο της ve-cadherin. Στην παρουσα διατριβη παρουσιαζονται στοιχεια που διευρυνουν τις γνωστες δομικες και λειτουργικες ιδιοτητες της ve- c στην πλασματικη μεμβρανη. Συγκεκριμενα η παρουσια του μοριου αυτου πυροδοτει την συναθροιση του φωσφολιπιδιου pip2, του σηματοδοτικου μοριου cdc42 και πιθανον του κυτταροσκελετου των μικροσωληνισκων. Τα αποτελεσματα αυτα φωτιζουν το ρολο που εχει η δυναμικη της ακτινης στη συγκροτηση των συνδεσμων προσκολλησης του ενδοθηλιου και η εισαγουν για πρωτη φορα τη σημασια των μικροσωληνισκων σε αυτη. Τα δεδομενα ανοιγουν το δρομο για τη διερευνηση αγνωστων μεχρι σημερα λειτουργιων της ve-cadherin στην κυτταρικη προσκολληση και τη μεταγωγη σηματος.