Μελέτη της GSK-3β σε πρωτεϊνικό και μοριακό επίπεδο σε οικογενή και σποραδικά καρκινώματα μαστού

Abstract

INTRODUCTION. Breast cancer represents the most common malignancy and cause of cancer -related deaths in female population Worldwide .Although we observe an increase of new-diagnosed cases the death percent is diminuished. This fact is due to new and extensive models of screening ,the new generation of mammography and new therapeutic approaches.This statistic data impones as to expand our researching horizons towards promising fields of reliable diagnostic, therapeutic and prognostic factors. AIM.The aim of this study was the investigation of: Ο σκοπός της παρούσης μελέτης είναι: 1) The expression pattern of protein kinase GSK-3β in primary invasive breast carcinomas(sporadic and familial) , 2) The existence of mutations in the exons 5 and 6(chr. 3q13.3)of the gene GSK-3β . The results will be correlated with the : α) classical clinicopathological parameters(age,menopausal status,tumor size,histological type,nuclear grade of malignancy, stage of disease,hormone receptors) b) overall survival(OS) and progression free survival(PFS) c) biological markers (ER, PR ,β-catenin, AKT, m-TOR). MATERIALS AND METHODSA)The material is consisted of 266 females with primary invasive breast cancer: a)154 sporadic cases, b)112 familial and c) 20 samples of mammary tissue negative to malignancy. The definition of the immunohistochemical expression and of the mutations of the gene GSK-3β will be held in slides of paraffin embedded tissue. B) We applied the three step imunohistochemical method avidin-biotin-hyperoxydase complex. The antibody we used is the rabbit polyclonal GSK-3β (H-76), in dilution 1:70. C) For the study of possible mutations of the gene GSK-3β,exons 5 and6 we used the method of QIAamp DNA Mini Kit/ PCR, with the respective primers,and electrophoresis in agar gel . The fact of bibliographic absence of this kind of mutations forced us to perform trials of acceptable credibility of the method(temperature,time and number of reaction cycles) and then followed the sequencing of PCR in the cases of our study. D) The results and the individual correlations were valuated with statistic methods ,Chi-square test for the biological markers, individual(log rank test) and multivariate( Cox”s hazard regression model) for the valutation of the survival(OS and PFS) . As level of for all the analysis is considered the p<0.05. It is used the SPSS, version 17.00 (SPSS Inc, Chicago ,IL).RESULTS GSK-3β was detected at the cytoplasm of the cancer cells in 57%(152/266),in the stromal fibroblasts in 28,7%(76/266) and in both populations(malignant and fibroblasts) in 27%(72/266).Neither cytoplasmic or stromal expression was associated with any of the classical clinicopathological parameters(lymphnode metastasis,menopausal status,tumor size,histological type,nuclear grade of malignancy, stage of disease,) or familial history.The cytoplasmic localization of the protein was positively associated with the expression of HER-2(p=0.045) and Akt ( p=0.039) ,and inversely with protein PTEN (p=0.011).The stromal expression of GSK-3β correlated positively with the expression of protein caspase-3 (p=0.020)and inversely with the expression of estrogen receptors (ER) (p=0.035),and of the immunohistochemical expression of Ki-67(p=0.015 ) and pAkt ( p=0.046). Neither cytoplasmic or stromal expression was found to to have any impact on overall survival(OS) and progression free survival(PFS) ,although in the subgroup of patients with HER-2 negative,was found to exert an unfavorable impact progression free survival(PFS) (p=0.021 .Even so over expression of GSK was observed, no activating mutations in the exons 5 and 6 of the gene GSK-3β kinas was found. This fact could be related to after- transduction modifications or inhibition of the natural inhibitors..CONCLUSIONS The role of protein kinas GSK-3β in the evolution of the cancer is not defined yet. Many studies support the oncogenic and others the antioncogenic activity.In breast cancer the absence of mutations ,a fact that is well documented to all neoplastic or not diseases ,do not allowed the targeted therapeutical approach at molecular level.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο καρκίνος του μαστού είναι η κυριότερη αιτία θανάτου σχετιζόμενου με καρκίνο στις γυναίκες σε παγκόσμιο επίπεδο. Παρότι παρατηρείται αύξηση της συχνότητας πρωτοεμφανιζόμενης νόσου, οι ρυθμοί θανάτου μειώνονται. Το γεγονός αυτό οφείλεται, κυρίως στην ενημέρωση ,στα μοντέλα πρόληψης, στην εκτενή χρήση της μαστογραφίας και στην πρόοδο των εφαρμοζόμενων θεραπευτικών μέσων . Το δεδομένο αυτό επιβάλλει την διεύρυνση των ερευνητικών μας οριζόντων προς πεδία που υπόσχονται αξιόπιστα αποτελέσματα στην διάγνωση, πρόγνωση και θεραπεία. ΣΚΟΠΟΣ Ο σκοπός της παρούσης μελέτης είναι: 1) Η διερεύνηση του προτύπου έκφρασης της πρωτεϊνικής κινάσης GSK-3β σε διηθητικά καρκινώματα μαστού (σποραδικά και οικογενή), 2) Η ύπαρξη τυχόν μεταλλάξεων στο γονίδιο της GSK-3β που εδρεύει στο χρωμόσωμα 3q13.3. Τα αποτελέσματα που θα προκύψουν θα συσχετιστούν με: α) κλασσικές κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους (ηλικία, εμμηνοπαυσιακή κατάσταση, μέγεθος όγκου, ιστολογικός τύπος, ιστολογικός και πυρηνικός βαθμός κακοήθειας, στάδιο της νόσου και ορμονικούς υποδοχείς), β) ολική και ελευθέρα νόσου επιβίωση των ασθενών, γ) βιολογικούς δείκτες (ER, PR ,β-κατενίνη, AKT, m-TOR). Τελικός σκοπός είναι να βρεθούν συσχετισμοί της έκφρασης της GSK-3β σε πρωτεϊνικό και μοριακό επίπεδο σε σποραδικά ή και οικογενή διηθητικά καρκινώματα μαστού. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑΑ) Υλικό-μέθοδοςΤο υλικό αποτελείται από: α) 154 σποραδικά διηθητικά καρκινώματα μαστού, β) 112 οικογενή διηθητικά καρκινώματα μαστού και γ) 20 δείγματα μαζικού ιστού, αρνητικά για κακοήθεια που θα αποτελέσουν την ομάδα ελέγχου (control). Ο προσδιορισμός της έκφρασης της GSK-3β στα διηθητικά καρκινώματα μαστού θα γίνει σε τομές παραφίνης με την εφαρμογή ανοσοϊστοχημικών μεθόδων. Η ανίχνευση τυχόν μεταλλάξεων του γονιδίου της GSK-3β θα γίνει με απομόνωση από τομές παραφίνης και χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR).Β) Έκφραση της πρωτεϊνικής κινάσης GSK-3β με ανοσοϊστοχημεία. Εφαρμόστηκε ανοσοϊστοχημική μέθοδος τριών βημάτων (αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης) για τον προσδιορισμό της έκφρασης της πρωτεϊνικής κινάσης GSK-3β σε τομές παραφίνης. Η αντιγονική αποκάλυψη έγινε με θέρμανση των τομών με διάλυμα EDTA pH 8.0 (Trilogy), σε φούρνο μικροκυμάτων για 15 λεπτά. Το αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν το rabbit polyclonal GSK-3β (H-76), σε αραίωση 1:70.Γ) Ανίχνευση μεταλλάξεων στα εξώνια 5 και 6 του γονιδίου gsk-3βΓια την ανίχνευση της ύπαρξης τυχόν μεταλλάξεων στα εξώνια 5 και 6 του γονιδίου της GSK-3β εφαρμόστηκε, μετά από απομόνωση του DNA από ιστικές τομές παραφίνης (QIAamp DNA Mini Kit), η μέθοδος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) με τους αντίστοιχους εκκινητές (primers) και ακολούθως ηλεκτροφόρηση σε gel αγαρόζης. Δεδομένης της απουσίας βιβλιογραφικών αναφορών σχετικά με μεταλλάξεις στα συγκεκριμένα εξώνια του γονιδίου, σε πρώτη φάση έγινε αλληλούχιση (sequencing) των προϊόντων της PCR, σε τυχαία περιστατικά, για τον καθορισμό των επιμέρους φυσικών παραγόντων (θερμοκρασία, χρόνοι και αριθμοί κύκλων αντίδρασης), με σκοπό τη βελτιστοποίηση των συνθηκών της μεθόδου και την ασφαλή προτυποποίησή της. Μόλις τα αποτελέσματα της τεχνικής διαδικασίας κρίθηκαν αξιόπιστα και επαναλαμβανόμενα ακολούθησε η αλληλούχιση (sequencing) των προϊόντων της PCR, στα περιστατικά της παρούσης μελέτης.Δ) Στατιστική μεθοδολογίαΓια τη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε η μονοπαραγοντική ανάλυση χ2 για τη συσχέτιση με τους βιολογικούς δείκτες, καθώς και μονοπαραγοντική (log rank test) και πολυπαραγοντική (Cox regression model) για τη συσχέτιση με την επιβίωση των ασθενών. Τα ανοσοϊστοχημικά δεδομένα που χρησιμοποιήθηκαν στη στατιστική επεξεργασία προκύπτουν από τα έως τώρα ανευρεθέντα στοιχεία της μελέτης μας, τα δε μοριακά δεδομένα όσο αναφορά τις μεταλλάξεις στα εξώνια 5 και 6 του γονιδίου της GSK-3β προέκυψαν και αυτά από τα στοιχεία της μελέτης μας. Τα στατιστικά που χρησιμοποιήσαμε στην διαδικασία βελτιστοποίησης της μεθόδου δεν αναφέρονται. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑΗ GSK-3β εντοπίστηκε στο κυτταρόπλασμα των καρκινικών κυττάρων των διηθητικών καρκινωμάτων μαστού σε 133 (57.1%) περιπτώσεις, καθώς και στις στρωματικές ινοβλάστες σε 67 (28.7%) περιπτώσεις, από το σύνολο των 266 περιπτώσεων που μελετήθηκαν. Ταυτόχρονη καρκινική και στρωματική ανοσοεντόπιση της GSK-3β παρατηρήθηκε σε 63 (27%) περιπτώσεις Η κυτταροπλασματική και στρωματική έκφραση της GSK-3β στα καρκινικά κύτταρα δεν συσχετίσθηκε με καμία από τις κλασικές κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους του καρκινώματος μαστού(μέγεθος νεοπλάσματος,στάδιο νόσου,εμμηνοπαυσιακή κατάστασηιστολογικός τύπος,πυρηνικός βαθμός κακοήθειας,διήθηση επιχώριων λεμφαδένων)ούτε με το οικογενειακό ιστορικό.Η κυτταροπλασματική εντόπιση της πρωτεΐνης GSK-3β συσχετίστηκε παράλληλα με την ανοσοϊστοχημική έκφραση των πρωτεϊνών HER-2 και Akt (p=0.045 και p=0.039, αντίστοιχα) και ανάστροφα με την έκφραση της πρωτεΐνης PTEN (p=0.011) Η στρωματική έκφραση της GSK-3β συσχετίστηκε παράλληλα με την έκφραση της πρωτεΐνης κασπάση-3 (p=0.020) και ανάστροφα με την έκφραση των οιστρογονικών υποδοχέων (ER) (p=0.035) και την ανοσοϊστοχημική έκφραση των πρωτεϊνών Ki-67 και pAkt (p=0.015 και p=0.046, αντίστοιχα) Η κυτταροπλασματική έκφραση καθώς και η ανοσοεντόπιση στις στρωματικές ινοβλάστες της πρωτεΐνης GSK-3β δεν βρέθηκε να ασκεί κάποια επίδραση στην ολική και ελευθέρα νόσου επιβίωση στο σύνολο των ασθενών και στις υποομάδες των σποραδικών και οικογενών καρκινωμάτων, τόσο στη μονοπαραγοντική όσο και στην πολυπαραγοντική στατιστική ανάλυση. Ωστόσο, η κυτταροπλασματική έκφραση της πρωτεΐνης βρέθηκε να ασκεί μη ευνοϊκή επίδραση στην ελευθέρα νόσου επιβίωση των ασθενών με HER-2 – αρνητικά καρκινώματα μαστού (p=0.021), στη μονοπαραγοντική στατιστική ανάλυσηΓια την ανεύρεση τυχόν ενεργοποιητικών μεταλλάξεων (activating mutations) στα εξώνια 5 και 6 του γονιδίου της GSK-3β κινάσης, επελέγησαν 40 περιστατικά στα οποία παρατηρήθηκε υπερέκφραση της πρωτεΐνης καθώς και 10 ως αρνητικοί μάρτυρες. Ωστόσο, παρά τις δοκιμές για τον προσδιορισμό των βέλτιστων συνθηκών, δεν παρατηρήθηκαν τέτοιου είδους μεταλλάξεις. Το γεγονός αυτό μπορεί να υποδηλώνει ότι η υπερέκφραση της πρωτεΐνης GSK-3β στον καρκίνο του μαστού πιθανά οφείλεται σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις ή σε καταστολή των φυσικών της αναστολέων. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Ο ρόλος της πρωτεινης GSK-3β στην εξέλιξη του καρκίνου ακόμα δεν έχει τυποποιηθεί πλήρως καθώς υπάρχουν μελέτες με αντικρουόμενα ή και παράδοξα αποτελέσματα. Υπάρχουν μελέτες που υποστηρίζουν την ογκοκατασταλτική δράση της πρωτεΐνης σε κάποια καρκινώματα και άλλες που αποδίδουν στην πρωτεΐνη ογκογόνο .Η απουσία μεταλλάξεων ,εύρημα παρατηρούμενο σε όλες τις νεοπλασματικές και μη νόσους ,δεν έχει επιτρέψει έως τώρα την στοχευμένη θεραπευτική προσέγγιση.