Μελέτη και εκτίμηση αντοχής του μικροβιακού πληθυσμού στην acne vulgaris

Abstract

Acne vulgaris is a particulary common skin disease that affects people of all age groups, with more severe disease’s manifestations during adolescence and beyond its completion. The lesion is located in the hair follicle, with common allocation in the face, the back and the chest. It is considered to be multifactorial disease. Among the factors that trigger acne is genetic impact (gene mutations and polymorphisms of gene allocations), nutrition, products with high glycemic index, psychological stress, oxidative stress in molecular level, but no one of these factors can be considered of greater importance. The pathophysiology of the disease is based on the interaction between the following factors: heperactivity of sebaceous glands (seborrhea), the anatomy of pilosebaceous follicles, anoxic environment that promotes the microbial colonization of pilosebaceous unit, especially by Propionibacterium Acnes, and the immune response that promotes inflammation.P. acnes is an anaerobic Gram- positive bacterium of the Propionibacterium family and its species are the following P.acnes, P. avidum, P.innocuum, P. granulosum and P. propionicus. All the species of the family product propionic acid as one of the final products of their metabolism as it is implied by their name. P. acnes is part of the normal microbiota of skin epidermis, of oral cavity, of nasopharynx, of gastrointestinal and urogenital human system. Acne is conducted by the P.acnes enzymes that promote the exacerbation of the inflammation (hyalouronidase, neurominidase and acid phosphatase), the production of lipase and bacterial antigen that stimulate the local inflammation, the secretion of inerleukines that promote the development of comedones, the production of chemotactic factors, the attraction of macrophages and the secreted hydrolases that cause tissue degradation.Concerning acne treatment either systematic either topical, antibiotics are provided for over thirty years. The wide use of antibiotics in acne treatment is probably mainly responsible for the development and the spread of resistant Propionibacteria strains. However, the causative association between topical antibiotic therapy and increases microbial resistance has not been sufficiently documented. There are no data concerning this field in Greece.The aim of this diplomatic assay is to examine the frequency of the pathogen isolation in patients with moderate or severe acne, the study of the species, of the resistance and its underlying mechanisms and the genotyping and the analysis of the clonallity of the species. Swabs collected by the patients were used to inoculateTryptone-Yeast Extract-Glucose (TYG) agar plates supplementedwith 4% furazolidone for growth inhibition of staphylococci and other Gram-positive bacteria of the normal flora. Genus and species identification of strains was performed using standard methodology with 16S rRNA. PCR and sequencing. Erythromycin, clindamycin, vancomycin, penicillin, co-trimoxazole, doxycycline, minocycline and ciprofloxacin MICs were determined using the gradient strip method and MIC Test Strips (Liofilchem, 64026, Italy). Erythromycin, clindamycin and tetracycline mechanisms of resistance were determined using PCR and sequencing of the domain V of 23S rRNA and 16S rRNA, as well as the presence of the ermX gene. Typing was performed using the multi locus sequence typing (MLST) methodology.Specimens were collected from 76 examined patients that were diagnosed with acne, aged between 14 and 35 years old and some of them were subjected to multiple isolations. All strains that have been isolated were sensitive to tetracyclines, penicillin, vancomycin, ciprofloxacin and minocycline. Twenty-three isolates out of 79 (29.1%) exhibited resistance to both of antimicrobiotic preparations of ML group (erythromycin and clindamycin, while two additional isolates (2.5%) were resistant only to erythromycin. The underlying molecular mechanisms were point mutations A2059G and A2058G. MLST typing of the P. acnes resistant isolates revealed that lineage type IA1 (ST-1, 3 and 52) prevailed (12/18; 66.7%), whilst lineage type IA2 (ST-2 and 22) accounted for five more isolates 27,8%).In conclusion, Propionibacterium spp. from moderate to severe acne vulgaris in Greece are frequently resistant to erythromycin/clindamycin but not to tetracyclines, mainly due to the point mutations A2059G and A2058G. P. acnes resistant isolates were more clonally related than susceptible ones and belonged to a limited number of MLST types.

H κοινή ακμή (acne vulgaris) είναι μια ιδιαίτερα κοινή δερματική νόσος που πλήττει ανθρώπους σε όλες τις ηλικιακές κλάσεις, με πιο σοβαρές εκδηλώσεις της νόσου στην εφηβεία και μετά το πέρας της. Η βλάβη εντοπίζεται στο θύλακο της τρίχας, με συνηθισμένη εντόπισή στο πρόσωπο, στην πλάτη και σε μικρότερο βαθμό στο στήθος. Θεωρείται πολυπαραγοντική νόσος. Ορισμένοι παράγοντες που συσχετίζονται με την πυροδότηση της ακμής είναι η γενετική επιρροή (μεταλλάξεις γονιδίων και πολυμορφισμοί γενετικών τόπων), η διατροφή, τα προϊόντα με υψηλό γλυκαιμικό δείκτη, το άγχος, το οξειδωτικό στρες στα κύτταρα, αλλά ένας βασικός αιτιολογικός παράγοντας δεν μπορεί να θεωρηθεί σημαντικότερος από τους υπόλοιπους. Η παθοφυσιολογία της νόσου στηρίζεται στην αλληλεπίδραση των εξής παραγόντων, που αλληλεπιδρούν: υπερδραστηριότητα σμηγματογόνων αδένων (σμηγματόρροια), ανατομία του τριχοσμηγματογόνου θυλάκου, ανοξικό περιβάλλον που ευνοεί τον αποικισμό του τριχοσμηγματογόνου πόρου από μικροβιακούς παράγοντες, κατά κύριο λόγο από το Propionibacterium acnes, και η ανοσολογική απάντηση που επάγει τη φλεγμονή. Το P.acnes είναι ένα Gram-θετικό αναερόβιο βακτηρίδιο, του γένους Propionibacterium, και τα είδη που συναντώνται είναι τα εξής: P. acnes, P. avidum, P. innocuum, P. granulosum και P. propionicus. Όλα τα είδη του γένους παράγουν προπιονικό οξύ, ως ένα από τα τελικά προϊόντα του μεταβολισμού τους, όπως υποδηλώνει το όνομά τους. Το είδος P. acnes, αποτελεί μέρος της φυσιολογικής χλωρίδας της εξωτερικής επιφάνειας του δέρματος, της στοματικής κοιλότητας, του ρινοφάρυγγα, του γαστρεντερικού και του ουρογεννητικού συστήματος του ανθρώπου. Στην ακμή οδηγούν η παραγωγή των ενζύμων από το P. acnes που προάγουν την επέκταση της λοίμωξης (υαλουρονιδάση, νευραμινιδάση και όξινη φωσφατάση), η παραγωγή λιπάσης και βακτηριακών αντιγόνων που διεγείρουν την τοπική φλεγμονή, η έκκριση ιντερλευκινών που επάγουν τη δημιουργία φαγέσωρων, η παραγωγή χημειοτακτικών παραγόντων, η προσέλκυση μακροφάγων και οι εκκρινόμενες υδρολάσες οι οποίες προκαλούν την αποικοδόμηση των ιστών. Για τη θεραπεία της ακμής χορηγούνται αντιβιοτικά, είτε συστηματικά είτε τοπικά παραπάνω από τριάντα χρόνια. Η ευρεία χρήση αντιβιοτικών για την αγωγή της ακμής πιθανόν ευθύνεται σε ένα μεγάλο μέρος και για την δημιουργία και τη διάδοση ανθεκτικών στελεχών Propionibacteria. Παρόλα αυτά σαφής αιτιολογικός σύνδεσμος μεταξύ τοπικής αντιβιοτικής θεραπείας και αυξημένης μικροβιακής αντοχής δεν έχει τεκμηριωθεί επαρκώς. Δεδομένα για το συγκεκριμένο θέμα στον Ελληνικό χώρο δεν υπάρχουν.Σκοπός της διατριβής ήταν να εξετασθεί η συχνότητα απομόνωσης του παθογόνου σε ασθενείς με μέτρια ή βαριά ακμή στην Ελλάδα, η μελέτη των ειδών, της αντοχής και των μηχανισμών της και η τυποποίηση και ανάλυση ης κλωνικότητας των στελεχών. Οι στιλεοί με υλικό από τους ασθενείς χρησιμοποιήθηκαν για να ενοφθαλμισθούν τρυβλία TYG agar που περιείχαν φουραζολιδόνη για την αναστολή ανάπτυξης σταφυλόκοκκων της φυσιολογικής χλωρίδας του δέρματος. Το είδος των στελεχών προσδιορίσθηκε με αλληλούχιση του γονιδίου του 16S rRNA. Η ελάχιστη ανασταλτική πυκνότητα (MIC) προσδιορίστηκε για τα εξής αντιβιοτικά: ερυθρομυκίνη, κλινδαμυκίνη, πενικιλίνη, βανκομυκίνη, κοτριμοξαζολη, δοξυκυκλινη, μινοκυκλίνη και σιπροφλοξασίνη, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Gradient strip και τις MIC Test Strips (Liofilchem, 64026, Italy). Οι μηχανισμοί αντοχής στην ερυθρομυκίνη, κλιδαμυκίνη και τετρακυκλινη προσδιορίστηκαν σε όλα τα ανθεκτικά στελέχη χρησιμοποιώντας PCR και προσδιορισμό της αλληλουχίας των γονιδίων της περιοχής V του 23S rRNA για τα ανθεκτικά στελέχη στην ερυθρομυκίνη και στην κλινδαμυκίνη και του 16S rRNA για τα ανθεκτικά στελέχη στην τετρακυκλίνη, καθώς και την παρουσία του γονιδίου ermX. Η τυποποίηση των στελεχών έγινε χρησιμοποιώντας τη μεθοδολογία προσδιορισμού αλληλουχιών πολυγενετικού τύπου (MLST).Συνολικά χρησιμοποιήθηκαν δείγματα από 76 ασθενείς, που εξετάστηκαν για κοινή ακμή, με ηλικιακό εύρος από 14 μέχρι 35 ετών, και από ορισμένους έγιναν πολλαπλές απομονώσεις. Όλα τα στελέχη που απομονώθηκαν ήταν ευαίσθητα στην τετρακυκλίνη πενικιλίνη, την βανκομυκίνη, την σιποφλοξασίνη και την μινοκυκλίνη. Είκοσι τρία στελέχη από τα 79 (29,1%) ήταν ανθεκτικά και στα δυο αντιμικροβιακά σκευάσματα της ομάδας ML (ερυθρομυκίνη και την κλινδαμυκίνη), ενώ δύο στελέχη (2,5%) ήταν ανθεκτικά μόνο στην ερυθρομυκίνη. Οι υποκείμενοι μοριακοί μηχανισμοί ήταν οι σημειακές μεταλλάξεις A2059G και A2058G. Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας πολυγενετικού τύπου που διενεργήθη σε 25 στελέχη P. acnes (18 ανθεκτικά και 7 ευαίσθητα στελέχη) έδειξε συσχέτιση μεταξύ των σημειακών μεταλλαγών και των τύπων MLST των ανθεκτικών στελεχών, αλλά όχι συσχέτιση στα ευαίσθητα στελέχη. Ο προσδιορισμός των ανθεκτικών στελεχών μέσω MLST των P. acnes έδειξε ότι επικρατούσαν οι γενεαλογικοί τύποι ΙΑ1 (ST-1, 3 και 52) (12/18, 66,7%), ενώ οι τύποι ΙΑ2 (ST-2 και 22) αντιστοιχούσαν σε πέντε επιπλέον στελέχη 27,8%). Καταληκτικά τα Propionibacterium spp. που απομονώθηκαν από μέτρια έως σοβαρή ακμή είναι συχνά ανθεκτικά στην ερυθρομυκίνη / κλινδαμυκίνη αλλά όχι στις τετρακυκλίνες, κυρίως λόγω των σημειακών μεταλλάξεων A2059G και A2058G. Τα στελέχη P. acnes με αντοχή ήταν περισσότερο συγγενικά από τα ευαίσθητα και ανήκουν σε έναν καθορισμένο αριθμό τύπωνMLST.